염색체 분석 과정

 

1. 검체선택

 

혈액학 업무로 염색체 검사를 의뢰하는 임상의는 염색체 분석을 위한 적절한 검체를 제공해야 할 필요가 있다. 가장 좋은 검체는 종양세포를 포함한 것으로 악성림프종의 경우에는 침윤된 림프절 생검 조직이 가장 적절하다. 골수 검체는 골수증식성질환과 골수이형성증후군, 만성림프구성백혈병과 급성백혈병을 가진 환자에서 필요하며 만성림프구성백혈병과 피부 T세포 림프종인 경우에는 말초혈액 검체가 더 유용하다.

무효천자(dry tap)인 경우에는 골수생검이나 말초혈액 검체로 염색체 검사를 할 수 있다. 골수를 침범한 질환일 경우는  골수 검체가 말초혈액 검체보다 좋다. 혈액검체의 단지 60%만이 적절한 세포분열 중기 세포를 얻을 수 있으므로 일반적으로 95% 이상이 염색체 검사에 적절한 검체를 제공해 주는 골수 검체가 진단적으로 보다 민감하다. 염색체 분석에서 혈액은 주로 상당히 진행된 질환에서 유익하며 골수를 이용할 수 없는 경우에 마지막 수단으로서 사용된다.

특별한 경우에는 다른 종류의 검체들이 필요한데 만약 뇌척수액이나 다른 부위로의 전이가 의심되면 그 부위의 검체를 얻어야 한다. 염색체 검사는  흔히 예기치 못한 상황에서도 이루어질 수 있으므로 검체가 적거나 분열한 세포가 없다고 해서 제외시켜서는 안된다. 만성골수성백혈병이 재발되는 눈의 초자체액에서도 염색체 검사를 성공적으로 시행한 바가 있다. 염색체 검사는 흉막유출의 원인이 되는 악성 혈액질환을 밝힐 수도 있다. 흉막액에서 림프종은 흔히 일반적인 세포학적 검사보다 세포유전학적 검사로 더 쉽게 진단할 수 있다.

세포유전 검사실에서  검체에 대한 임상소견과 어떤 질환이 의심되는지, 또는 왜 검체를 보냈는지 아는 것이 도움이 되는데  이런 정보를 미리 알고 있으므로 해서 보다 적절한 검사 방법을 택할 수 있게 된다. 백혈구 수치를 알고자 할 때도 있는데 이것은 배양시에 너무 많은 세포를 배지에 넣지 않도록 하기 위해서이다. 혈액검체는 높은 백혈구수를 가지지만 분열세포의 수는 너무 낮아서 염색체 분석에는 적합하지 않다. 종양질환에서 대부분의 치료제제의 기능은 세포분열을 방해하는 것이므로 이런 제제는 검체에서 세포분열 중기세포를 얻는 것을 방해한다. 이런 제제의 작용은  알킬화, 데옥시리보핵산에 삽입되거나 방추사를 방해하거나 또는 그 외 다양한 기전을 통해서 이루어진다. 대개 치료 후 2-3주에 성공적인 염색체 검사가 가능하다. 비록 종양을 치료하기 위해 사용된 제제들이 염색체에 일시적인 비정상을 초래하지만 염색체적으로 비정상인 세포군의 동정을 방해하지는 못한다.

2. 검체채취 및 운송

  

만약 임상의가 염색체 분석방법에 익숙하지 못하다면 많은 검사실이 검체의 채취와 운송을 위한 특별한 장비와 도구를 가지고 있으므로 검체를 얻기 전에 세포유전검사실에 연락을 취하는 것이 유용하다.

통상적인 염색체 분석은 세포분열이 이루어지는 세포에서 행하여지며 가장 적절한 검체는 세포분열능을 가진 살아 있는 종양세포를 가진 것이다. 그러므로 세포를 얼리거나 고정하지 않도록 해야 한다. 골수검체는 1.0ml 이상이면 안되는데 1.0ml 이상인 경우에는 응고될 가능성이 커지기 때문이다. 대개 0.25-0.50ml의 골수 검체일 때 성공적인 염색체 검사가 이루어 질 수 있다.

검체는 살균 소독된 방법으로 얻어서 heparin sodium이 든 플라스틱 용기에 넣는다. 염색체 검사에는 신선한 검체가 유용하므로 만약 골수검체를 먼 거리의 세포유전 검사실로 보내야 된다면 운송방법에 특별한 주의를 요한다.

검체를 배지에 넣어서 보낼 수도 있고 colcemid, 저장성 용액이든 50 ml 원심분리관 등을 이용해서 검체를 부분적으로 처리해서 보낼 수도 있다. 대개는 신선한 고정액에 넣어서 보내는 것이 좋다. 고정액은 메탄올과 glacial acetic acid로 만든다. 세포가 고정이 되면 운송시간이 길더라도 문제가 되지 않는다. 만약 검체가 말초혈액이라면 heparin sodium이 든 멸균된 주사기에 7-10 ml의 혈액을 채취 해야한다. 검체는 즉시 heparin sodium이 들어 있는 병으로 옮기고 용혈되거나 응고되지 않도록 주의한다. 어떤 항응고제들은 세포의 생존력에 나쁠 수도 있으므로 heparin sodium이 가장 좋은 항응고제 이다.

염색체 검사는 1.0-3.0 ml의 림프절 생검 검체에서도 할 수 있다. 검체는 멸균된 조직배양액이나 멸균된 Hank's balanced salt 용액이 들어있는 마개가 있는 멸균된 용기에 넣어서 운반해야 한다. 검체는 실온 상태 또는 냉장온도로 검사실에 보내질 수 있다. 이외의 다른 검체들은 미리 검사실과 연락을 하는 것이 중요하며 흉막유출액 10 ml, 뇌척수액 5 ml, 그 외 많은 다른 검체에서도 성공적인 분석이 이루어 질 수 있다. 

3. 검체처리

  

직접법(direct technique)에서 검체는 채취후 즉시 처리되어야 한다. 먼저 colcemid로 1시간 처리후 따뜻한 저장성 용액(0.075M KCl)을 넣고 15분간 둔 후 3:1 methanol-glacial acetic acid로 고정한다. 이 방법은 골수 검체에 더 좋으며 성공율이 92% 이상이다.이 방법으로 시행하면 24시간내에 검사결과를 얻을 수 있으며 특히 급성림프구성백혈병에서 도움이 된다. 그러나 급성전골수구성백혈병(ANLL-M3)과 같은 혈액질환에서는 좋지 못하다.  

24-48시간의 단기배양법(short term culture)은 많은 검사실에서 이용하고 있는데  기본배지는 RPMI 1640, 우태아혈청(fetal bovine serum), 항생제로 구성되며 T세포나 B세포 세포분열물질(mitogen)은 사용하지 않는다. 세포는 24-48시간 동안 37oC에서 배양하며 저산소환경(5% 산소, 5% 이산화탄소, 90% 질소)에서 배양한다. 배양후 colcemid, 저장성용액, 고정을 거쳐 세포를 수획한다.

이 방법은 골수검체에서 성공율이 90% 이상이며 특히 급성전골수구성백혈병에서 좋다. 골수의 단기배양은 25ml T-flask를 사용하며 수획단계에서는 원심분리용 튜브로 검체를 옮긴다. 몇 번의 세척과정 후 세포부유액을 슬라이드 위에 2-3방울 떨어뜨린다. 이 방법은 세포의 손실이 많고 수획과정을 용수법으로 시행해야 하는 단점이 있다.

동소(in situ) 방법에서는 세포를 chamber slide에서 배양하고 수획도 하기 때문에 세포의 손실을 피할 수 있고 자동 수획기계(robotic harvesting maching)를 이용해서 수획할 수도 있다. 또 다양한 방법의 다양한 배양을 동시에 쉽게 할 수 있으며 적은 검체로도 가능하다. 만성림프구성백혈병 환자의 혈액이나 골수검체에서 염색체 검사는 종양세포가 분열되도록 자극하는 세포분열물질을 사용하는 것이 도움이 된다. Phytohemmagglutinin(PHA), 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13- acetate(TPA), pokeweed mitogen (PWM), 불활성화된 Epstein-Barr virus 등을 이런 목적으로 사용할 수 있다.

그러나 세포분열물질은 정상 T세포와 B세포도 역시 자극을 한다. 또 모든 세포가 세포분열물질에 반응하는 것도 아니다. 혈액질환의 염색체 검사에서 검체를 처리하는 가장 좋은 방법은 무엇일까? 직접배양법과 24시간 무자극배양과 mehtotrexate 동조배양법(synchronization method)을 100개의 무작위 골수검체에 대한 맹시험으로 비교한 결과 염색체 형태, 분열지수, 염색체 이상 세포군의 검출력 등에서 세 방법간에 유의한 차이는 없었다. 그럼에도 불구하고 어떤 한 방법이 또 다른 방법보다 좋을 수 있으므로 한 검체에 대해 적어도 두가지 이상의 방법을 사용하는 것이 필요하며 그 중 하나는 직접배양법이어야 한다. 

4. 염색방법 및 과정

  

염색체검사를 위한 분염법(banding technique)에는 여러 가지가 있지만 가장 흔한 것은 G-분염법과 Q-분염법이다. G-분염법에는 많은 방법이 있는데 trypsin으로 짧은 시간 처리한 뒤 Leishman 염색으로 염색을 하는 방법은 선명한 염색대를 얻을 수 있어서 각 염색체의 동정과 미세한 구조적 결함의 발견을 쉽게 할 수 있으나 염색이 일정하지 않기 때문에 많은 수의 세포분열 중기세포를 이용할 때 좋다. Q-분염법은 염색시약 quinacrine mustard로 1-2분간 염색을 한 뒤 형광현미경으로 보는 것으로 염색대가 수분 안에 흐려지고 G-분염법보다 선명하지 않은 단점이 있지만 더 일정하게 염색이 되므로 소수의 세포분열 중기세포가 있거나 염색체 형태가 좋지 않은 경우에 이용할 수 있다.

5.세포분열 중기세포의 분석

  

대부분의 검사실은 적어도 20개의 세포분열 중기세포를 분석한다. 실제로 많은 검사자들은 세포분열중기세포를 무작위로 선택하지는 않으며  보고하는 것보다 더 많은 수의 세포분열 중기 세포를 분석한다. 세포분열 중기세포를 완전히 분석하기 위해서는 많은 수의 염색체를 분석하고 구조적 결함 여부를 알기 위해서 각각의 염색대 형태를 관찰해야 한다. 해상력 수준은 적어도 400개 정도의 염색대를 나타내야 하는데 이는 가장 선명한 세포분열 중기세포의 단배수성 염색군에서 동정할 수 있는 염색대가 400개 이상임을 의미한다.

  염색체 간의 겹침이나 균일하지 못한 염색상태, 세포분열중기세포의 결여 등으로 인해 모든 세포분열 중기세포에서 이런 정도의 해상력이 가능하지는 않지만  이런 모든 장애에 직면해서 검사자는 단지 자신의 최선을 다할 수 있어야 한다. 이때 무엇보다 중요한 것은 검사자가 선명하고 좋은 세포분열 중기 세포만을 선택하지 않도록 하는 것이다. 왜냐하면 흔히 가장 상태가 나쁜 세포분열 중기세포가 종양세포군이기 때문이다. 그러나 종양세포군에서도 정상세포보다 더 잘 염색이 되는 경우가 있으므로 모든 종류의 세포분열 중기세포를 분석하는 것이 좋다. 경험이 세포유전 검사자의 가장 중요한 도구이다. 혈액질환에서 흔한 염색체 이상과 친숙한 검사자는 이상이 있는 경우에 보다 잘 발견할 수 있으므로 검사자는 가능한 한 각 세포분열 중기세포에 대한 많은 정보와 구조적 이상뿐 아니라 추가 또는 결실된 염색체의 동정에 대한 기록을 가지고 있어야 한다.

6. 핵형분석

  

분석된 세포분열 중기세포는 대표적인 것으로 만든 몇 개의 형식적인 핵형분석을 사진으로 만들어야 한다. 이것은 상동 염색체사이의 염색상을 보다 객관적으로 비교할 수 있고 미세한 이상도 발견할 수 있게 해주며 현미경만으로 검사하는 것보다 더 객관적인 방법으로 염색체 이상을 동정할 수 있게 한다. 일부 세포유전학자는 하나의 세포군에 대해 적어도 두 개의 핵형분석을 요구하며 각각의 아세포군당 적어도 하나의 핵형 분석을 하도록 제안하고 있다. 상당한 염색체 진화와 조작중의 인공물 등에 의해 분석된 모든 세포분열 중기세포가 약간씩 차이가 있을 수 있으므로 이것이 항상 가능한 것은 아니다.

7. 세포군의 정의

  

악성혈액질환의 증명은 종양세포군의 존재로 할 수 있다. 세포군의 표준세포유전적 정의는 동일한 추가 염색체나 동일한 구조 이상이 적어도 두 개의 세포분열 중기세포에서 관찰되는 것이다. 동일한 결실 염색체가 세 개 이상의 세포분열 중기세포에서 보여야만 한다. 염색체 결실에 대한 보다 엄격한 규정은 조작상의 잘못에 의한 확대해석을 없애는 데 도움이 된다. 왜냐하면 검체의 처리과정동안 염색체의 결실이 삽입되는 경우 보다 더 많이 일어날 수 있기 때문이다.

염색체 이상이 정상 과정의 일부일 수도 있기 때문에 세포군의 정의에는 분석할 수 있는 많은 수의 세포분열 중기세포를 포함해야 한다. 그렇지만 전형적인 염색체 이상을 갖는 세포를 단 하나만 관찰할 수 있었다면 이를 보고해야 되며, 보고서에는 세포군을 정하는 최소한의 기준에는 못 미치더라도 진단적으로 중요할 수 있다는 설명을 해야한다.

 8. 결과보고

  

보고서에는 표준세포유전적 명명법을 사용해서 완전하고 형식적인 세포유전적 기술과 간단한 설명을 해야 한다. 검사결과를 확대해석하지는 말아야 하는데 예를 들어 8번 삼염색체(trisomy 8)가 급성백혈병의 증거라고 말하는 것은 적절하지가 않다. 왜냐하면 이런 진단은 세포유전적 결과보다는 골수내의 아세포 퍼센트에 의한 것이기 때문이다. 이런 경우는 8번 삼염색체를 갖는 세포군이 종양세포군에서 일정하게 관찰된다고 해야 적절하다.

NN, AN, 또는 AA로도 보고하는데 이는 비공식적인 약어로 NN은 모든 세포분열 중기 세포가 정상임을 나타내고 AA는 모두 비정상인 것이고 AN은 어떤 세포는 비정상이고 어떤 것은 정상인 경우이다. 결과보고 시에 대표적인 핵형분석을 함께 보고할 수도 있다. 이런 경우 사진에 구조적인 또는 수적인 이상을 지적해 주는 것이 혈액학자에게 도움이 될 것이다. 

(참조) 결과보고서 양식

 

 [참고문헌] McClatchey KD,Clinical Laboratory Medicine.Williams & Wilkins, Baltimore, USA,

                   pp731-735,1994.                                                     [2000년 12월25일 정리]