유전과 염색체 

(The Chromosomal Basis of Heredity ; Human Genome as Chromosomes)

 

     

    목 차

    1. 염색체 구조
    2. 세포분열 (cell division)
       1) 유사분열(mitosis)     2) 감수분열 (meiosis, reduction division)
    3. 염색체 기법 (techniques of chromosome study)
       1) 표본제작 방법          2) 자기방사법 (autoradiography)
       3) 염색체 분염법 (differential staining methods)
       4) 고정도 분염법 (high-resolution banding)
    4. 인체 염색체의 분류
       1) 염색체의 규정
       2) 인체핵형 (karyotype) 

     

    세포유전학(cytogenetics)은 염색체를 취급하는 학문이다.임상에서 염색체 분석은 산전 진단, 정신 박약, 성장 지연이나 다발성 기형, 이차 성징의 발육 이상, 불임증 및 유산을 포함하는 각종 질환 진단에 활용되고 있다. 또한 종양의 진단, 예후 추정, 치료제 선택, 치료효과 판정에도 필수적인 검사이다.

    염색체에 관한 여러 가지 검사기법의 개발과 분자유전학의 발전은 유전질환과 혈액종양의 병인론적 기전을 규명하는데도 많은 기여를 하였다.

C-banding             WA FISH

 

 

세포분열 과정에서 관찰되는 염색체(chromosome = chromo;color, some;body)는 염기성 색소에 짙게 염색되는 구조물로서 단백질의 골격구조에 DNA를 포함하고 있다. DNA의 분절은 유전단위인 유전자로 구성되는데 사람의 세포에는 약 3만개의 유전자가 있다.  유전자는 염색체에 선상으로 배열되어 좌위(locus)라고 하는 정확한 위치를 갖는다. 이들 좌위는 체세포에 있는 2개의 상동염색체의 동일한 위치에 있게 마련인데, 이를 대립인자(allele, allelomorph)라 하여 그 대립인자가 질이나 양적으로 같으면 동형접합(homozygous), 다를 경우에는 이형접합(heterozygous)이라 한다. 그리고 동일한 염색체에도 위치를 달리하는 많은 유전자를 포함하는데 이들 동일한 염색체에 위치하는 유전자들을 연관(linkage)한다고 하며, 생화학적으로 구성을 달리한다.

 

유전학적으로 어떤 형질을 나타낼 때는 유전형(genotype)과 표현형(phenotype)으로 표시하는데, 유전형은 유전자의 구성을 나타내고, 표현형은 유전자가 발현하는 구조적, 생화학적 또는 생리적인 표현실체를 말한다. 그래서 세포유전학(cytogenetics)은 염색체의 현미경적 현상을 관찰하여 세포분열 과정에 각 개체의 인자형과 표현형의 관계를 규명하는 것이다.

 

염색체의 연구에 가장 많이 이용되었던 동물 중에 하나가 초파리(Drosophila)이다. 초파리는 생명주기(life cycle)가 14일이면서 체세포의 염색체 수가 8개 밖에 되지 않아 세포유전학의 실험재료로서는 가장 적절한 것으로 이용되어왔다. 그런 점에서 사람의 염색체는 46개나 되어서 염색체를 연구하는데 많은 어려움이 따랐는데,  인체 세포유전학은 Tjio와 Levan (1956)에 의해서 정립되었다.

 

염색체는 상염색체(autosome)와 성염색체(sex chromosome)로 크게 대별한다. 사람의 체세포의 염색체는 46개인데, 부계 염색체(paternal chromosome)와 모계 염색체(maternal chromosome) 각각 22개의 상염색체와 성을 결정하는 중요한 역할을 하는 성염색체 1쌍으로 남성은 XY를, 여성은 XX를 갖고 있다. 여성은 성염색체가 XX로 구성되어 있어서 동형배우자성(homogametic sex)이라 하고, 남성은 XY로 구성되어 있어서 이형배우자성(heterogametic sex)이라 한다.

 

1. 염색체의 구조

 

염색체는 동식물 세포의 유사분열시에 방추체내에서 발견되는 염기성 색소에 짙게 염색되는 봉상의 구조물이다. 염색체는 세포에 있는 대부분의 DNA를 함유하고 있어서 유전정보 담체로 인식되었으며, 현재는 세포분열 중에 볼 수 있는 염색체에 한하지 않고 중간기나 분화한 핵내의 염색질을 포함하여 염색체라고 광범위하게 불리우게 되었다.

 

염색체 구조는 생물의 종과 품종 그리고 계통에 따라 특이성을 가지며, 핵분열 과정에 일련의 복잡한 행동을 보인다. 유사분열시에 나타나는 염색체에는 일차협착(primary constriction)이 나타나는데, 이곳에 동원체(centromere)가 있어서 이동기에는 여기에 방추사가 부착하여 양극으로 이동하는 것으로 생각한다. 동원체를 중심으로 하여 양측을 완(腕)이라 하는데 긴 쪽이 장완(long arm), 짧은 쪽은 단완(short arm)이다. 염색체를 분류하는 방법으로 크기와 모양을 이용하여 구분하는 방법이 있는데 염색체는 동원체의 위치에 따라서 중부(metacentric), 차중부(submetacentric), 차단부(acrocentric), 단부(telocentric) 등으로 불리운다.

 

           

 

염색체는 유사분열 전기의 이른 시기부터 중기에 걸쳐서 장축으로 종열되는데 이들 두 개로 나뉘어진 부분이 염색분체(chromatids)이다. 염색분체는 세포분열과정에서 서로 떨어져서 각각 독립된 기질과 두개의 염색사(chromonema)를 갖는 낭염색체(daughter chromosome)가 된다. 염색분체와 세포주기와의 관계를 보면 세포분열 후 간기의 G₁상(phase)에서는 단염색분체(single chromatid)이고, DNA가 복제된 S상 이후에는 두 개의 동일한 염색분체가 이루어지며, 다시 유사분열 후에 각 낭세포는 단염색분체로 된다.

 

염색체의 미세구조를 보면 사람에 있어서는 체세포에 약 2m의 DNA가 포함되어 있는 것으로 보며, 뉴클레오좀(nucleosomes), 30nm 섬유, 고리와 scaffold형의 구조로 구성되어 있다. 뉴클레오좀은 H2A, H2B, H3 그리고 H4가 각각 2분자로 되어 있는 히스톤 분자(histon octamer)의 복합체이다. 둥근 각 복합체는 인접한 뉴클레오좀과 20∼100bp(base pair)간격으로 146bp의 DNA가 둘러 있다. 가시 염색체에서와 같이 간기의 세포에 있는 DNA도 이 형태로 있을 것으로 본다. 그리고 30nm의 섬유는 염색질의 기본단위인데 H1과 다른 단백질이 연합되어 뉴클레오좀의 끈으로 이루어진다. 또한 중앙 scaffold는 염색체의 축을 이루는데, Sc 1과 Sc 2의 두 단백질을 가지며 이는 DNA의 supercoiling을 조절하는 효소일 것으로 본다.  한편 염색질 고리는 크기가 다양하며 scaffold로부터 방사상으로 있을 것으로 생각된다.img73.gif

 

염색질은 DNA, 염기성 단백질(histone) 복합체를 주성분으로 비히스톤 단백질 및 소량의 RNA를 포함하는 집합체이다. 이 염색질은 세포주기의 각 기와 유전적 활성 또는 불환성의 상태에 따라서 그 구조가 현저히 다르다. 즉 M기에는 고차구조체로서의 염색체가 되고, 간기에는 분산된다. 그리고 염색질은 진정염색질(euchromatin)과 이형염색질(heterochromatin)로 분류되는데, 이형염색질은 보다 치밀하여 세포학적 조작으로도 정염색질보다 더 진하게 염색된다.

 

일반적으로 염색체의 동원체 부근, 인 부착부분, 말단소립 등 특정 부위가 이형염색질로 나타나는 경우가 있으며, Y 염색체와 포유류의 여성에서 2개의 XX 염색체 중 이상 응축을 일으키는 1개의 염색체를 이형염색체(heterochromosome)이라고 한다. Heitz(1928)에 의해 이형염색질은 유전적으로 불활성 물질이라고 보고된 바 있다.

 

 

2. 세포분열 (cell division)

 

세포분열은 정상 체세포의 분열방법인 유사분열(mitosis)과 생식세포의 분열과정에 나타나는 감수분열(meiosis)로 구분한다.

 

1) 유사분열
세포는 유사분열에 의해서 그 수를 늘린다. 그 과정은 유전자의 복제(replication)에 따른 염색체의 복제와 세포의 다른 내용물을 포함하여 2개로 나누어짐으로써 완료되는데, 먼저 핵이 분열하고 곧 이어서 세포질이 갈라진다. 유사분열은 염색체가 나타나는  특징에 의해 편의상 다음과 같이 몇 개의 연속상으로 구분한다.

 

(1) 간기 (interphase)
세포분열이 끝난 후 다음 분열을 준비하는 시기이다. 이 시기의 핵을 대사핵(metadolic nucleus)이라고 하는데, 간기는 다시 G₁(gap 1)기, S(DNA synthetic)기 그리고 G₂(gap 2)기로 구분하며, DNA의 합성은 S기에 일어난다. 이 시기에는 염색체의 모양은 나타나지 않고, 길게 늘어난 모양의 염색사(chromonema)가 각각 1개씩의 동원체(centromere)를 가진 상태로 대사핵 속에 있게 된다.

 

(2) 전기 (prophase)
세포는 점차 구형으로 부풀고 핵 속에 나타나는 염색체 하나 하나는 2개의 꼬인 섬유상으로 되어 있는데, 전 길이에 걸쳐 조밀한 것이 특징이다. 전기의 진행에 따라 염색체는 점차 짧아지고 굵어지면서 종열(longitudinal split)에 의해서 염색분체를 이룬다. 한편 세포질에 있는 중심체(centrosome)가 2개로 갈라지면서 형성되어 양극으로 이동된 중심립(centriole)은 별모양으로 섬유상 구조를 방출해서 성상체(aster)를 이룬다. 그리고 2개의 중심립 사이에는 방추사(spindle fiber)가 수없이 나타나며, 모든 염색체는 방추사에 매달리게 된다.

 

(3) 중기 (metaphase)
중기에는 핵막의 붕괴와 더불어 제멋대로 자리잡고 있던 염색체들이 세포의 중앙부위인 적도면(equatorial plane) 상에 배열하는데, 이 때 배열한 염색체군을 핵판(nuclear plate) 또는 적도판(equatorial plate)이라 한다. 그리고 1개의 동원체에는 1개의 방추사가 붙어 있는 것이 보통이다.

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(4) 후기 (anaphase)
후기에는 적도면에 배열한 염색사가 각 염색체의 동원체 부분에서 분리되기 시작하여 완전한 2개의 자매염색체가 생기게 된다. 갈라진 자매염색체는 각기 양극으로 이동하게 되는데, 이 때 염색체들은 동원체의 위치에 따라서 특징이 잘 나타난다. 결국 세포의 양극에는 당초 모세포의 염색체 수와 동일한 수의 염색체가 모이게 된다.

 

(5) 말기 (telophase)
말기에는 염색체군과 세포질 사이의 경계면에 새로운 핵막이 생기며, 세포분열과정에서는 보이지 않던 인(nucleolus)이 나타나고, 염색체는 해체되어 길게 늘어진 염색사의 상태로 되돌아가는 시기이다. 이와 같이 핵분열이 끝나면 세포막 만입(furrowing)의 방법이다. 세포판형성(cell plate formation)에 의해서 세포질 분열이 이루어져 완전한 2개의 낭세포(daughter cell)의 형성으로 유사분열을 끝마친다.

 

이상과 같이 유사분열은 몇 가지 단계로 설명이 가능하나, 유사분열과정에서 유전적인 가장 큰 의의는 간기에서의 DNA의 정확한 복제와, 염색체의 분리과정에서 2개의 세포로 정확하게 분배되는 현상이다. 이것이 바로 유전물질의 연속성(genetic continuity)을 보장하는 기작이라고 할 수 있다.

 

2) 감수분열 (meiosis, reduction division)

 

감수분열은 생식세포를 형성하는데 따른 특수한 세포분열형이다. 감수분열에 의해서 형성된 각 낭세포는 모세포에 있는 염색체 수(2n)의 반수(n)를 갖게 되는데, 여기에는 2번의 계속되는 감수분열적 분열이 따른다(그림 2-5). 염색체의 수적 개념으로는 첫째 분열은 사분염색체(tetrads chromosome)에서 이분염색체(dyads chromosome)로 두번째 분열에서는 이분염색체에서 일분염색체(monad chromosome)로 된다.

 

배우자의 기원이 되는 정원세포(spermatogonium)와 난원세포(oogonium)의 시기에는 그 염색체 조성이 2n이고, 이들은 유사분열 양식의 핵분열로 세포 수효를 증가시키나, 세포주기의 어떤 시기가 되면 유사분열과는 다른 감수분열을 개시한다. 감수분열의 특징을 보면, 제 1분열의 전기에 각 상동염색체(homologous chromosome)는 서로 접합하여 2가염색체(bivalent chromosome)를 형성하고, 후기에는 각각 한 개씩 양극으로 분리되어 염색체 수는 반감된 2개의 중간기 핵을 형성한다. 그리고 다음에 이어지는 제2분열에서 각 염색체는 종열하여 그 반씩이 양극으로 이동한다. 이러한 연속적인 2회의 분열로 n개의 염색체를 가진 4개의 세포가 형성되는데, 이 때 상동염색체는 제1분열에서는 접합면에서 분리하고, 제2분열에서는 종열면에서 분리한다. 이러한 양식을 전감수(pre-reduction)라고 부르며, 제1분열에서는 감수적(reductional)으로, 제2분열에서는 균등적(equational)으로 분리된다. 그 반대현상을 후감수(post-reduction)라 한다.

 

(1) 제 1 분열 (1st meiotic division)

A. 전기 Ⅰ (prophase Ⅰ)
제1분열 전기는 다시 몇 개의 시기로 세분하여 특징을 가진다.
a. 세사기(leptotene stage) : 염색체는 매우 길어지고 나선은 풀어진다. 이 시기의 특징은 가늘고 긴 염색사가 핵 속에 균일하게 분산되어 있는데, 비록 DNA가 이 시기 이전에 복제되어 있어도 염색사는 현미경적으로는 단수로 나타난다.

b. 접합기(zygotene stage) : 상동염색체가 접합(synapsis)을 이루는 것이 특징이다. 한쌍의 염색체가 서로 2가염색체(bivalent chromosome)형으로 모여 평행으로 위치한다. 유사분열에서는 이런 쌍을 이루는 일이 없다.

c. 태사기(pachytene stage) : 이 시기의 염색체는 짧아지고 치밀하며, 두터워지고, 밀접하게 꼬여 더 진하게 염색된다. 그리고 2가 염색체는 가깝게 접촉하고, 각 염색체는 2개의 염색분체가 뚜렷하다.

d. 복사기(diplotene stage) : 한 개의 2가염색체는 4개의 염색분체로 되어 있기 때문에 사분염색체(tetrads chromosome)라고 한다. 이 때의 사분염색체에서는 4개의 염색분체 가운데 2개가 서로 교차(crossing-over)를 이룬다. 이 부분을 chiasma라고 하며, 여기에서 2개의 염색분체는 절단되어 다른 염색분체와 결합되는 것으로 생각되는데, 이 때에 유전적인 교차가 일어나는 것으로 추측한다.

e. 이동기 (diakinesis) : 전기 Ⅰ의 마지막 기로서 염색체의 꼬임이 더 치밀한 것이 특징인데, 염색체는 더 진하게 염색되고 더 짧아진다. 그리고 인은 없어지기 시작하여, 이동기 말에는 이미 볼 수 없게 된다. 이어서 핵막도 파괴되어 보이지 않게 된다.

 

B. 중기 Ⅰ(metaphase Ⅰ)
유사분열의 중기와 같이 이 시기에 염색체들은 적도판의 적도에 이동(terminalization)하여 배열한다.

 

C. 후기 Ⅰ(anaphase Ⅰ)
염색체가 세포의 반대극으로 이동되는데, 유사분열과 다른 것은 염색분체의 동원체에서 나누어지지 않고 상동염색체의 부계와 모계염색체가 각각 반대 방향으로 이동한다.

 

D. 말기 Ⅰ(telophase Ⅰ)
이 시기는 유사분열의 말기와 비슷하다. 염색체는 나선이 풀어져서 핵 속에 분산되고 인도 다시 형성된다. 그러나 어떤 생물(반시류, 백합과식물)에서는 핵막이 형성되지 않고 그대로 제2분열이 시작되는 것도 있다.

 

(2) 제 2 분열 (2nd meiotic division)
A. 전기 Ⅱ(prophase Ⅱ)
제2분열의 간기에는 DNA복제가 일어나지 않는다. 전기 Ⅱ는 기본적으로는 유사분열과 비슷하여, 염색체의 단축과 나선화의 시기이다.
B. 중기 Ⅱ(metaphase  Ⅱ)
2개의 염색분체는 종열로 동원체에서 분리되어 체세포분열 때와 같이 적도판에 배열한다.
C. 후기 Ⅱ(anaphase Ⅱ)
유사분열의 후기와 같이 염색체는 양극으로 이동한다.
D. 말기 Ⅱ(telophase  Ⅱ)
이 시기에서도 유사분열의 말기와 같이 염색체의 나선이 풀리고, 인과 핵막이 형성된다. 결국 감수분열은 2번의 분열에 의해서 4개의 세포로 되지만 염색체 수는 체세포 염색체 수의 반으로 된다.

 

(3) 교차 (chiasma & crossing-over)
감수분열의 특징은 모든 쌍을 이루는 상동염색체들이 접합을 이루어 제1분열 전기의 복사기에서 부터 중기를 거치면서 나타나는 키아즈마를 들 수 있다. 키아즈마는 교차(crossing-over)의 위치를 나타내는 것으로 상동염색체는 그 위치에서 절단되어 재조환(recombination)에 의해 분절을 교환한다. 사람에 있어서는 남성에서 감수분열 염색체의 세트 당 55, 여성에서는 50 정도의 키이즈마를 나타낸다. 그 수는 나이에 따라서 남성에서는 증가하고 여성에서는 감소한다. 그러나 비록 여성의 생식세포 형성과정에서 더 적은 키아즈마의 빈도가 나타나지만, 여성에서 연관유전자의 조환율이 높음으로써 여성이 남성보다 1.4배의 키아즈마 빈도를 갖는 것으로 추측하고 있다.

 

4) 연관과 유전자 재조합 (linkage and recombination)
같은 염색체에 위치하는 유전자는 연관한다. 이것은 멘델의 독립의 법칙을 반박하는 근거이다. 연관하고 있는 유전자들이 교차에 의해서 새로운 유전자 조환을 이루는데 이것을 유전자 재조환이라 한다.

 

5) 자매염색분체 교환 (sister chromatid exchange ; SCE)
SCE는 자매염색분체 간의 상호교환이다. 그들은 염색체의 형태적인 변화의 결과가 아니라 DNA 복제과정중 상동유전자에서 DNA의 절단과 재유합이 일어난 결과로 본다. 그 분자적 기전에 대해서는 아직 알려지고 있지 않으나, 이러한 현상은 DNA에 생긴 상해가 DNA의 복제과정에 복제와 연관되어 일어나는 현상이라 생각되며, 오염과 같이 생체 내의 DNA에 손상을 일으키는 경우 검출계로서 중요한 의미가 있다. 실험적으로 배양세포를 2번의 세포주기를 갖도록 하되, 처음 복제는 H³- thymidine의 존재하에서 DNA의 복제를 시행하고 다음 복제는 H³-thymidine이 없는 상태에서 시행하면, 세포분열 중기에 도달한 염색체는 자기방사법(autoradiography)의 관찰에서 자매염색분체의 한쪽은 방사성 물질에 의해서 표식이 되어 다른 쪽과 식별이 된다.

최근에는 H³- thymidine 자기방사법 대신에 bromodeoxyuridine(BUdR) 형광염색에 Giemsa염색법을 병용하는 방법이 개발되어 이용되고 있다. 즉 세포를 배양할 때 thymine 대신에 BUdR을 가한 배지에서 DNA가 2번 반복되도록 배양하되, thymine 대신에 BUdR이 DNA에 결합하도록 하여 염색체를 형광색소 33258 Hoechst와 Giemsa로 염색하면 구성 DNA 2중사슬중 한쪽에 bromouracil(BU)치환이 일어난 염색분체는 Giemsa염료에 진하게 염색되고, 양쪽에 BU치환이 일어난 DNA 2중사슬에 의한 염색분체는 약하게 염색된다.

SCE의 빈도는 특수한 유전적 이상에서 크게 증가되고 있는데, Bloom 증후군(Bloom’s syndrome)과 펜코니 증후군(Fanconi’s syndrome)을 그 예로 들 수 있다. Bloom 증후군은 출생시 저체중이고, 소인증, 광선과민증 그리고 안면의 모세관 확장성 홍반 등을 나타낸다.

 

6) 사람의 정자형성 (human spermatogenesis)

정자형성의 모든 과정은 성숙한 남성의 정소에 정세관(seminiferous tubule) 내에서 일어난다. 정세관의 가장자리에서 정자형성과정의 가장 초기 세포인 정원세포(spermatogonia)를 관찰할 수 있다. Clermont와 Leblond(1959)는 원숭이의 정원세포를 5단계로 구분하여, 가장 기초인 A1에서 부터 유사분열의 가장 뒤 단계인 B3로 나누었다. 그리고 마지막에는 유사분열에 의해서 제1정모세포를 형성하게 된다. 그리고 Haler와 Clermont(1963, 1964)는 방사성 동위원소인 thymidine을 이용한 실험에서 사람의 정자형성도 각 단계의 차이를 제외하고는 하등동물의 경우와 같다는 것을 보였다.

 

사람에서 46개의 염색체를 가진 제1정모세포는 23개의 염색체를 가진 제2정모세포를 만들기 위하여 제1차 감수분열은 진행하고, 각 제2정모세포에서는 다시 23개의 염색체를 가진 2개의 정세포(spermatid)를 만들기 위하여 제2차 감수분열이 일어난다. 그리고 정세포는 분열은 하지 않고 변태과정을 거쳐 정자(sperm, spermatozoa)를 형성하기 위하여 성숙한다. 정원세포에서 제1정모세포와 제2정모세포 그리고 정세포에서 변태(metamorphosis)를 거쳐 정자를 형성하는데 소요되는 기간은 약 64일 정도이다.

 

7) 사람의 난자형성 (human oogenesis)

난자는 난소의 피질 조직에 위치하는 난원세포(oogonium)에서 분화하는데, 각 난원세포는 여포(follicle)의 중앙에 있다. 사람의 제1난모세포(primary oocyte)는 임신 약 3개월째 태아의 난원세포에서 부터 분화가 시작된다. 출생시에 제1난모세포는 제1차 감수분열의 전기에 거의 도달해 있고, DNA가 복제되어 있다. 그리고 제1난모세포는 성적인 성숙이 이루어질 때까지 여러 해 동안 망상기(suspended prophase ; dyctyotene)에 머물러 있게 된다. 그래서 각 여포(follicle)는 12∼50년 후에 성숙(suspended meiotic division)이 다시 시작되어 배란의 시기를 달리한다. 결국 여성은 출생시 제1난모세포들이 제1차 감수분열의 전기를 완료하여 적어도 사춘기까지 감수분열의 휴식기에 들어간다.

 

여기에서 난자형성의 전반적인 과정을 보면, 우선 난원세포에서 제1난모세포가 되고, 제1감수분열로 제1난모세포는 제2난모세포와 제1극체를 형성하며, 제2차 감수분열이 바로 시작되어 제2난모세포가 배란되어 수란관을 지날 때도 계속된다(그림 2-9). 이 제2차 감수분열은 수정 후까지 완성되지 않는다. 결국은 제2차 감수분열에 의해서 성숙란과 제2극체를 형성한다. 난자형성과 정자형성은 유전적으로 다른 의미를 갖는다. 즉 여성에서의 제1차 감수분열 전기의 긴 기간은 연령의 증가에 의한 감수분열 염색체불분리(meiotic nondisjunction)의 모험이 증가되는 원인과 밀접한 관계를 가진다.    

 

 

3. 염색체 분석기법 (chromosome analysis techniques)

 

1) 표본제작 방법

염색체를 광학현미경으로 관찰하기 위해서는 세포주기(cell cycle)에서도 유사분열 중기의 세포에 나타나는 염색체를 대상으로 한다. 염색체의 분석을 위한 세포는 배양시에 빨리 분열하고 잘 자라야 한다.그래서 일반적으로 골수(bone marrow)나 피부 그리고 말초 혈액(peripheral blood)의 세포를 이용한다. 말초 혈액을 이용하는 경우 혈액에 있는 세포로 백혈구, 혈소판, 적혈구 등이 있으나, 혈소판은 그 수가 적고, 적혈구는 분화 과정에 핵이 소실되어 염색체가 없으므로 백혈구를 대상으로 하게 마련이다. 여기에서는 말초 혈액을 이용하여 염색체를 분석하는 가장 보편적인 방법을 소개하겠다.

 

a. 말초혈액 10ml 정도 채혈하여, heparin으로 항응고시킨 뒤 0.1ml의 phytohemagglutinin(PHA)를 첨가하여 4℃에서 1시간 정도 방치하고, 1,000rpm에서 1분간 원침하여 백혈구를 포함한 혈장을 분리한다. 여기에서 PHA는 red kidney bean에서 축출한 물질로서 유사분열 자극제(mitogenic agent)이며 적혈구를 응축하는 작용을 한다.
b. 분리한 백혈구 부유액 1ml를 조직배양 배지(tissue culture medium : 그 중에 예로서 RPMI1640 배지 8ml와 우태아혈청 1ml)에 주입하고, PHA 0.1ml를 다시 첨가하여 37℃에서 72시간 배양한다.
c. 배양 후 약 70시간에 colcemid(또는 colchicine)를 배양액 ml당 0.4㎍을 첨가하고 약 2시간을 추가 배양한다. colcemid는 방추사의 작용과 동원체의 분리를 억제한다.
d. 이를 500rpm으로 원침하여 배양액을 버리고 세포만 모아서 1% sodium citrate 저장액 10ml에 약 15분간 처리한다.
e. 이를 다시 500rpm으로 3분간 원침하여 세포만 모아서 methanol과 glacial acetic acid를 3ː1로 혼합한 용액으로 15분간 고정하는 것을 몇 번 반복한다.
f. 고정한 시료를 이미 탈지한 슬라이드 글라스 위에 파이펫으로 2∼3방울 떨어뜨려 화염건조법으로 표본을 제작하는데, 화염이 꺼진 후 수평으로 흔들어 세포를 파괴한다. 다음에 Giemsa 액으로 염색하여 커버 글라스를 덮고, 약 1,000배 배율의 현미경으로 검경한다.
g. 제작된 표본은 중기의 염색체를 나타내는 세포를 택하되, 가능하면 염색체가 겹치지 않은 세포를 골라서 관찰하고, 염색체를 촬영하여 인화한 후 각 염색체를 재단하여 핵형(karyotype)을 작성한다.

 

2) 자기방사법 (autoradiography)

사람의 염색체와 같이 수가 많은 경우에는 각 개의 염색체를 식별한다는 것이 그렇게 용이하지 않다. 그래서 고안된 방법 중에 하나가 자기방사법을 이용한 것이다. 세포를 배양할 때 H³- thymidine을 가하면 DNA 합성과정에 H³- thymidine이 결합되어 이 방사성 물질을 포함하는 염색체는 표본 제작시 부착한 필름을 감광함으로써 쉽게 구별이 가능하다. 사람의 염색체에서는 유사분열 주기의 S기 후반부에 DNA를 합성하는 것들이 있어서 보통 B, D, E, G군의 염색체를 식별하는데 이용한다. 특히 여성에서의 2개의 XX 염색체 중의 하나는 후반복제(late replicating)의 특징이 있다.

 

3) 염색체 분염법 (differential staining methods)

1970년 이전까지는 염색체를 관찰하기 위해서 보통염색방법을 이용했었으나, 이후 횡문양식(banding pattern)으로 염색체를 염색하는 여러 가지 특수한 방법이 고안되었다. 여기에 그 중에 몇 가지 특수한 염색 방법을 소개한다.

a. Q banding : Caspersson 등(1970)이 고안한 방법으로 염색체를 quinacrine mastard 또는 그 유사 화합물로 염색하여 형광현미경으로 관찰한다. 각각 쌍을 이루는 염색체들은 밝은 횡문과 어두운 횡문(Q band)으로 특수한 무늬를 만들어낸다. Q band는 염색체의 분류기준을 위한 참조 횡문으로 이용한다. 특히 Y 염색체는 강한 형광을 발하고 간기에도 구별된다. 그래서 간기는 Barr body를 광학현미경으로 관찰하거나, Y염색체를 형광현미경으로 관찰할 수 있는 시기라 하겠다.

b. G banding : 가장 흔히 이용되는 방법으로서, 염색체를 염색체 단백질의 변성물질인 trypsin으로 처리한 후 Giemsa 색소로 염색하면 어두운 부분과 밝은 염색횡문(G band)의 무늬로 염색된다. 어두운 횡문은 어두운 Q 횡문과 일치한다. Giemsa banding은 Q banding보다 경제적이면서, 단순해서 Q banding과 같은 효과를 얻기 때문에 널리 이용된다.

 

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c. R banding : 염색체에 열처리한 후 Giemsa 염색을 하면 명암의 염색횡문(R band)이 Q와 G banding에서 보이는 모양과 반대로 나타난다. R banding은 Q나 G banding과 같은 정보를 주고 있으나 널리 이용되지는 않는다.
d. C banding : 이 방법은 동원체부위와 구조적 이질염색질(constitutive heterochromatin)을 포함하는 다른 구역, 즉 1번과 16번 염색체의 2차 협착부위(secondary constriction)와 Y염색체의 장완의 원분절(distal segment)을 염색하는 특수한 방법이다.
e. NOR staining : ammoniacal silver을 이용하여 nucleolar organizing reginos, 즉 28S와 18S ribosomal gene을 포함하는 부수체를 갖는 염색체의 경상부(stalk)를 염색하는 방법으로 사용한다.

 

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4) 고정도 분염법 (high-resolution banding)

간혹 전기횡문염색법(prophase banding)이라고 불린다. 전기와 중기 전반의 염색체는 유사분열 중기 처리에서 볼 수 있는 반수성 염색체에서의 300-400개 횡문염색대(band)보다 훨씬 많은 800-1,400개가 나타난다.

 

         

Conventional G-banding                              High-resolution banding


4. 인체 염색체의 분류

 

1) 염색체

염색체를 연구하는 데는 우선 염색체의 수를 결정하고, 다음에 각 염색체를 특징에 따라서 분류하는 것이 필요하다. 사람의 정상 체세포는 46개의 염색체를 갖고 있는데, 이는 다른 생물에 비해서 수적으로 많아서 오래 전에는 세포유전학의 연구대상으로는 적절치 못했다는 이유가 여기에 있다. 따라서 사람의 염색체를 일정한 기준에서 분류하고, 각 염색체의 세포유전학적인 특징을 규정하기 위하여 여러 차례 국제 세포유전학회가 열렸는데, 특기할 만한 회의와 내용은 다음과 같다.


1960년  Denver    : 염색체 명명법의 기본체계를 만들어 상염색체의 순서(1-22)를 결정.
1963년 London    : 상이한 염색체끼리 문자로 염색체군(A-G)을 결정.
1966년 Chicago   : 염색체의 수적, 구조적 이상을 논의하고 p, q 등의 기호를 결정.
1971년 Paris        : 각 염색체의 염색대(band), 부위(region) 등을 결정.
1978년 Paris        : 염색체를 규명하기 위해 용어들을 자세한 정의함.

 

2) 핵형 (karyotype)

염색체는 우선 상염색체와 성염색체로 구분하고, 다음의 몇 가지 설정 기준에 따라 각 염색체를 다시 분류한다. 핵형이란 그의 특성을 염색체의 수와 형태로 나타낸 것으로 핵형의 기본 기준을 보면 다음과 같다.

 

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a. 염색체의 크기(size) : 모든 염색체를 먼저 크기로 순서를 정한다. 염색체의 크기는 상대적 길이(relative length)로 나타내는데, 이는 X염색체를 포함한 반수 염색체의 길이에 대한 특정 염색체의 비율로 정한다.

b. 동원체의 위치(position) : 염색체는 동원체(centromere)를 중심으로 하여 단완(short arm : p-petit의 약자)과 장완(long arm : q)으로 구분되는데, 동원체 지수(centromere index), 즉 그 염색체의 전체 길이에 대한 단완의 길이의 비율을 이용한다.
            동원체 지수 = (p/p+q) × 100

c. 이차 협착(secondary constriction)의 유무 : 모든 염색체의 동원체가 있는 부위를 일차 협착이라 하는데, 염색체에 따라서는 일차 협착외의 다른 부위에 특수한 RNA 또는 단백질을 포함한 이차 협착이 있는 경우가 있다.

d. 부수체(satellite) : 염색체에 따라서는 부수체가 있는 경우가 있다. 위의 기준으로 사람의 핵형은 크게 상염색체와 성염색체로 구분하여, 상염색체를 1번에서 22번까지 분류하고 이들을 다시 A군(group)에서 G군의 묶음으로 나눈다. 그리고 성염색체는 X염색체와 Y염색체로 구분한다.

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① A군 : 1,2,3번의 가장 큰 3쌍의 염색체이며, 크기와 동원체의 위치에서 다른 염색체군과 쉽게 구별된다. 2차 협착이 1번 염색체의 장완 기단부(proximal portion)에 가끔 보인다.

② B군 : A군보다 짧으며, 4, 5번의 차중부(submetacentric) 염색체군이다.

③ C군 : 6번에서 12번까지의 염색체군으로서, 차중부 염색체이다. 9번 염색체는 장완의 기단부에 2차 협착이 가끔 보인다.

④ D군 : 13∼15번인 중간 크기의 차단부(acrocetric) 염색체로서, 13번 염색체는 단완에 현저한 부수체를 갖고 있으며, 14번 염색체도 단완에 작은 부수체가 있다. 이들 부수체는 항상 보이는 것은 아니다.  

⑤ E군 : 16∼18번의 중부(metacentric) 또는 차중부 염색체인데, 16번 염색체는 거의 중부 염색체이며, 가끔 장완에 2차 협착이 보인다.  

⑥ F군 : 19번과 20번 염색체로 거의 중부염색체이다.

⑦ G군 : 21번과 22번 염색체군인데, D군에 비해서 크기가 작은 차단부 염색체이다. 이들은 단완에 부수체를 갖고 있다.  

⑧ 성염색체(sex chromosome) : X염색체와 Y염색체이다. X염색체는 상염색체군의 C군에서 7번과 8번 염색체 사이의 크기이고, 중부 염색체에 가깝다. 정상 여성은 이 X염색체를 2개 갖고 있으나 남성은 X염색체와 Y염색체를 갖고 있는데, Y염색체는 이질염색질로 형광법으로 쉽게 감별되며, G군 크기의 차단부 염색체이고 장완에 2차 협착이 나타난다. 부수체를 갖고 있지 않으며, 장완이 서로 가깝게 접해있다. 정상 남성은 X염색체와 Y염색체를 갖는 이형배우자성이다.

 

 

References

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  [재정리 2004년 3월1일]