Fluorescent in-situ Hybridization (FISH)

 

 

특정 DNA 염기서열( DNA sequence)의 존재 유무를 규명하기 위한 형광동소보합법(fluorescence in situ hybridization, FISH)은 형광물질이 부착된 DNA 소식자(probe)를 사용한다. 염색체에 소식자 또는 탐침자를 부착시키는 검사과정을 교잡반응(hybridization)이라 부르고, 염색체에 부착되는 DNA 소식자는 자외선에 노출될 때 형광을 내면서 대응하는 DNA 염기서열의 유무 및 위치를 보여주게 된다.

[참조]

 

 

 

 

  


 

슬라이드 제작 방법 및 형광동소보합법(FISH)

 

 

LSI procedure - 가능한 빛을 차단하여 실험한다.

 

1. 70% formamide/2x SSC를 미리 73±1°C로 데워둔 후 검체 슬라이드를 넣은 후 5분간 변성시킨다.

2. 변성시킨 슬라이드를 70%, 85%, 100% EtOH에 각각 1 분씩 담군다.

3. LSI probe 1ul + 2 ul purified H2O + 7ul LSI Hybridization buffer를 넣고 1-3초간 원심분리한 후 잘 섞어준다.

4. 소식자(probe)를 73±1°C에서 변성시킨다.

5. Specimen target area에 미리 혼합한 소식자를 떨어뜨린 후 coverslip을 기포가 생기지 않게 잘 덮어준다.  ( 대략 22 x 22 mm or 슬라이드의 반정도 )

6. Robber cement로 coverslip 위를 봉한다.

7. 6번의 슬라이드를 37 °C에서 6-16시간 정도 교잡반응시킨다. (overnight )

8. 소식자의 비특이적 결합을 없애기 위해 아래와 같이 세척한다.

   (1) 50%formamide/2x SSC를 미리 46 ±1°C로 데운 후 10분간 3회 세척한다.

   (2) 2x SSC를 미리 46 ±1°C로 데운 후 10분간 세척

   (3) 2x SSC/0.1%NP-40를 미리 46 ±1°C로 데운 후 5분간 세척

* 8. Rapid Wash  - 위의 7번 대신 사용- 동시에 사용하면 안됨

  (1) 0.4x SSC/0.3% NP-40을 미리 73±1°C에서 데운 후 슬라이드를 넣고 2분간 세척.

    - 시간을 정확히 지킬 것.

  (2) 실온에서 2x SSC/0.1% NP-40에 슬라이드를 5초에서 1분간 세척.

9. 슬라이드를 공기 중에 말리고, 대조염색(counterstain)을 한다.

10. Coverslide를 덮은 후 형광현미경으로 관찰한다.

 

 

Using Hybrite System

 

1. Hybrite의 Heating Surface에 젖은 타올로 습기를 유지시킬 수 있도록 홈 사이에 끼워놓는다.

2. Specimen sample에 원하는 부위를 다이아몬드 펜으로  표시한다.

3. Probe를 표시한 부분에 얹고, coverslip을 덮은 후 Rubber cement로 봉한다.

4.  (1) cultured lymphocytes와 골수는 Melt Temp를 75°C, 1분간

    (2) paraffin embedded samples는 Melt Temp를 85 °C, 1분간으로 맞춘다.

5. Hybridization temp 37°C, Hybridization  time 4시간에서 overnight로 맞춘다.

6. 슬라이드를 Hybrite에 넣은 후 run 시킨다. 이 때, 슬라이드 수량이 12장이 되도록 꼭 맞춘다. - 만일 검체가 12장보다 적은 경우 빈 슬라이드를 넣어 준다.    

7. Hybridization time이 완전히 끝나면, Rapid Wash를 한다.

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   (1) 0.4x SSC/0.3% NP-40을 미리 73±1°C에서 데운 후 슬라이드를 넣고 2분간 세척.

    - 시간을 정확히 지킬 것. - 만일, 슬라이드수가 4장이 안될 경우 빈 슬라이드를 넣어준다.

   (2) 실온에서 2x SSC/0.1% NP-40에 슬라이드를 1-3초간 흔들어준 후 5초에서 1분간 담근다.

    - 만일, 슬라이드 수가 4장이 안될 경우 빈 슬라이드를 넣어준다.

8. 어두운 암실에서 검체 슬라이드를 말린다.

9. 10ul 대조염색액을 떨어뜨린 후 coverslip을 덮어준다.

 

CEP DNA FISH Probes

 

CEP procedure - 가능한 빛을 차단하여 실험한다.

 

1. 70% formamide/2x SSC를 미리 73±1°C로 데워둔 후 검체 슬라이드를 넣은 후 5분간 변성시킨다.

2. denature 시킨 슬라이드를 70%, 85%, 100% EtOH에 각각 1분씩 담군다.

3. CEP probe 1ul + 2ul purified H2O + 7ul CEP Hybridization buffer를 넣고 1- 3초간 원심분리한 후 잘 섞어준다.

4. Probe를 73±1°C에서 변성시킨다.

5. Specimen target area에 미리 혼합한 probe를 떨어뜨린 후 coverslip을 기포가 생기지 않게 잘 덮어준다. (대략 22 x 22 mm or 슬라이드의 반정도)

6. Robber cement로 coverslip 위로 봉한다.

7. 6번의슬라이드를 42°C에서 0.5시간에서 16시간 정도 hybridization한다.(overnight )

8. Probe의 비특이적인 결합을 없애기 위해 아래와 같이 세척한다.

   (1) 50% formamide/2x SSC를 미리 46 ±1°C로 데운 후 10분간 3회 세척한다.

   (2) 2x SSC를 미리 46 ±1°C로 데운 후 10분간 세척

   (3) 2x SSC/0.1%NP-40를 미리 46 ±1°C로 데운 후 5분간 세척

* 8. Rapid Wash  - 위의 7번 대신 사용- 동시에 사용하면 안됨

   (1) 0.4x SSC/0.3% NP-40을 미리 73±1°C에서 데운 후 슬라이드를 넣고 2분간 세척.

        - 시간을 정확히 지킬 것.

   (2) 실온에서 2x SSC/0.1%NP-40에 슬라이드를 5초에서 1분간 세척.

9. 슬라이드를 공기 중에 말린다.

10. 대조염색(count stain)을 한다.

11. Coverslide를 덮은 후 형광현미경으로 관찰한다.

 

 

Using Hybrite System

 

1. Hybrite의 Heating Surface에 젖은 타올로 습기를 유지시킬 수 있도록 홈 사이에 끼워놓는다.

2. 검체에 원하는 부위를 다이아몬드 펜으로  표시한다.

3. Probe를 표시한 부분에 얹고, coverslip을 덮은 후 Rubber cement로 봉한다.

4. (1) cultured lymphocytes와 골수는 Melt Temp를 75°C, 1분간

    (2) paraffin embedded samples는 Melt Temp를 85°C, 1분간으로 맞춘다.

5. Hybridization temp 42°C, hybridization time 0.5시간에서 overnight로 맞춘다.

6. 슬라이드를 Hybrite에 넣은 후 검사를 진행시킨다. 이 때, 슬라이드 수량이 12장이 되도록 꼭 맞춘다.     - 만일 sample이 12장보다 작은 경우 빈 슬라이드를 넣어 준다.

7. Hybridization time이 완전히 끝나면, Rapid Wash를 한다.

   (1) 0.4x SSC/0.3% NP-40을 미리 73±1°C에서 데운 후 슬라이드를 넣고 2분간 세척.

    - 시간을 정확히 지킬 것.- 만일, 슬라이드수가 4장이 안될 경우 빈 슬라이드를 넣어준다.

   (2) 실온에서 2x SSC/0.1%NP-40에 슬라이드를 1-3초간 흔들어준 후 5초에서 1분간 담근다.   

    - 만일, 슬라이드수가 4장이 안될 경우 빈 슬라이드를 넣어준다.

8. 어두운 암실에서 sample 슬라이드를 말린다.

9. 10ml 대조염색액를 떨어뜨린 후 coverslip을 덮어준다.

 

 WCP Chromosome Paint DNA  FISH Probes

 

WCP procedure - 가능한 빛을 차단하여 실험한다.

 

1. 70% formamide/2x SSC를 미리 73±1°C로 데워둔 후 검체 슬라이드를 넣은 후 5분간 변성시킨다.

2. 변성 시킨 슬라이드를 70%, 85%, 100% EtOH에 각각 1분씩 담군다.

3. WCP probe 1ul + 2 ul purified H2O + 7ul WCP Hybridization buffer를 넣고 1- 3초간 원심분리한 후 잘 섞어준다.

4. Probe를 73±1°C에서 변성시킨다.

5. Specimen target area에 미리 혼합한 probe를 떨어뜨린 후 coverslip을 기포가 생기지 않게 잘 덮어준다.  (대략 22 x 22 mm or 슬라이드의 반정도)

6. Robber cement로 coverslip 위로 봉한다.

7. 6번의 슬라이드를 37 °C에서 4-16시간 정도 hybridization한다. ( overnight )

8. Probe의 비특이적인 결합을 없애기 위해 아래와 같이 세척한다.

   (1) 50% formamide/2x SSC를 미리 46 ±1°C로 데운 후 10분간 3회 세척한다.

   (2) 2x SSC를 미리 46 ±1°C로 데운 후 10분간 세척

   (3) 2x SSC/0.1% NP-40를 미리 46 ±1°C로 데운 후 5분간 세척

* 8. Rapid Wash  - 위의 7번 대신 사용- 동시에 사용하면 안됨

   (1) 0.4x SSC/0.3% NP-40을 미리 73±1°C에서 데운 후 슬라이드를 넣고 2분간 세척.

        - 시간을 정확히 지킬 것.

   (2) 실온에서 2x SSC/0.1%NP-40에 슬라이드를 5초에서 1분간 세척.

9. 슬라이드를 공기 중에 말린다.

10. 대조염색을 한다.

11. Coverslide를 덮은 후 형광현미경으로 관찰한다 .

 

 Using Hybrite System

 

1. Hybrite의 가열표면에 젖은 타올로 습기를 유지시킬 수 있도록 홈 사이에 끼워놓는다.

2. Specimen sample에 원하는 부위를 다이아몬드 펜으로  표시한다.

3. Probe를 표시한 부분에 얹고, coverslip을 덮은 후 Rubber cement로 봉한다.

4. (1) cultured lymphocytes와 골수는 Melt Temp를 75°C, 1분간

    (2) paraffin embedded samples는 Melt Temp를 85 °C, 1분간으로 맞춘다.

5. Hybridization temp 37°C, Hybridization  time 4시간에서 overnight로 맞춘다.

6. 슬라이드를 Hybrite에 넣은 후 진행시킨다. 이 때 슬라이드 수량이 12장이 되도록 꼭 맞춘다. - 만일 검체가 12장보다 작은 경우 빈 슬라이드를 넣어준다.    .

7. Hybridization time이 완전히 끝나면 신속하게 세척한다.

  (1) 0.4x SSC/0.3% NP-40을 미리 73±1°C에서 데운 후 슬라이드를 넣고 2분간 세척.

   - 시간을 정확히 지킬 것.

   - 만일, 슬라이드수가 4장이 안될 경우 빈 슬라이드를 넣어준다.

  (2) 실온에서 2x SSC/0.1%NP-40에 슬라이드를 1-3초간 흔들어준 후 5초에서 1분간 담근다.

   - 만일, 슬라이드수가 4장이 안될 경우 빈 슬라이드를 넣어준다.

8. 어두운 암실에서 검체 슬라이드를 말린다.

9. 10ml 대조염색액를 떨어뜨린 후 coverslip을 덮어준다. 

 

검체처리 프로토콜 (sample preparation protocols)

 

 

1. Uncultured Amniocyte Specimens

 

Amniotic Fluid 전처리 방법

 

1. 양수 검체를 받자마자 15ml 플라스틱 원심관에 넣어 1000rpm에서 10분간 원심분리한다.

 - 검체접수시 검체 양과 색깔을 적어 둔다. 모체 세포의 혼입은 FISH 결과에 영향을 미치므로 혈액이 섞인 검체는 부적절하다.

2.  Pasteur pipet으로 상층액을 완전제거한 후 시험관을 조심스럽게 쳐주면서(tapping) 세포를 재부유시킨다.  ; 37°C로 미리가온한 1x trysin/EDTA 3ml를 넣어 검체를 충분히 섞고 37°C Water bath에서 15-20분간 방치한다.

3.  37°C 수조로부터 시험관을 꺼낸 후 37°C로 미리 데워둔 5% FBS/PBS 5ml를 넣어 trypsin의 활성을 중단시킨다.

4. 1000rpm에서 10분간 원심 분리한 후 Pasteur pipet으로 조심스럽게 상층액을 제거한다.

5. 37°C로 미리 데운 0.56% KCL 4~5ml을 첨가하여 pellet을 잘 섞어 재부유시킨 후 37°C에서 20분간 방치한다.

6. 차갑게 해둔(4°C에 보관) Carnoy 고정액 2ml를 세포부유액에 천천히 넣어준다. 만일, 세포를 고정시킨 부유액을 오래 보관하고 싶다면 -20°C에 둔다.

 

 

슬라이드 만들기

 

Water Bath Set Up : 수조를 acrylic hood 안에 둔다. 수조안에 원심분리관 rack을 둔다. Rack 위에 검체 슬라이드를 얹을 것이기 때문에 검체 슬라이드가 젖지 않을 정도의 수위로 수조 안에 물을 최대한 넣어준다. 수조는 65°C로 맞추어 준다. 만일 습기가 45% 이하면 hood 안에 가습기 넣어준다..

 

1. Pasteur pipet로 세포부유액을 흡인한다.

    깨끗한 슬라이드를 Cold fix가 들어가 있는 Coplin Jar안에 담근다.

    슬라이드를 꺼낸 후 고정액을 슬라이드에 완전히 덮은 후 기울여둔다.

2. 65°C 수조 위에 9-12 inches되는 곳에 슬라이드를 잡고 있고, 슬라이드 1-2inches 위치에서 세포부유액을 미리 표기 해둔 슬라이드에 떨어뜨린다.

3. 즉시 슬라이드를 수조 안에 있는 rack에 올려 둔다. 모든 검체 슬라이드를 만든 후 온도와 습기 유지를 위해 hood의 문을 닫아 준다.

4. 10분 후 슬라이드를 꺼내어 뒷면을 잘 닦아 준다. 이 슬라이드 들은 이제 FISH를 위해 사용 가능하며, 만일 오래 보관할 경우에는 실온에서 밤시간(overnight) 동안 말린 후 plastic bag에 건조제를 넣은 후 잘 봉하고, - 20°C에서 보관한다.

 

2. 골수(bone marrow)

 

골수검체 채취 과정

 

1. 50ml conical tube에 colcemid가 들어있는 nomal saline solution 20ml을 넣은 후 200㎕의 ethidium bromide를 첨가한다.

2. 1ml의 골수를 1번의 시험관에 넣은후 saline solution과 골수세포가 잘 혼합되도록 조심스럽게 여러번 전도(invert)하면서 섞어준다.

 

Harvest 과정

 

1. 실온에서 1-2시간 정도 방치한다.

2. 1,000rpm에서 8분 동안 원심분리한다.

3. 약 2ml정도의 상층액이 남도록 상층액을 완전히 제거하고 난 후, 조심스럽게 vortex mix하여 세포를 재부유 시키고, 살짝 원심분리(spin down)하여 세포가  바닥에 가라앉도록 한다.

4. Pasteur pipet을 이용하여 실온의 KCl 저장액(0.075M) 4ml을 천천히 넣은 후 조심스럽게 vortex mix한다. 그 다음 시험관 벽을 따라 KCl 저장액(0.075M)이 30ml이 될 때 까지 부어넣고 역시 세포가 완전 부유되도록 조심스럽게 vortex mix한다

5. 실온에서 20분간 방치한다

6. 1,000rpm에서 8분 동안 원심분리한다.

7. 약 2ml 정도의 상층액이 남도록 상층액을 완전히 제거하고 난 후, 조심스럽게 vortex하여 세포를 재부유 시키고, 살짝 spin down하여 세포가 원심분리관 바닥에 모이게 한다.

8. Pasteur pipet을 이용하여 2:1의 고정액 1ml을 넣은 후 조심스럽게 vortex하여 세포를 재부유 시키고, 2:1 고정액이 30ml 될 때까지 붓고 역시 세포가 완전부유되도록 조심스럽게 vortex mix한다.  

9. 1,000rpm에서 8분동안 원심분리한 후 약 2ml 정도의 상층액을 남기고 완전히 제거한다. 이 때 상층액을 제거할 때 시험관 주의에 세포가 묻지 않도록 한다.

10. 8, 9번의 과정을 상층액이 깨끗해질 때까지 반복한다.

11. 세포가 가라앉도록 실온에 30분간 둔다.

12. 상층액내의 세포가 완전히 부유되도록 한 후 만약 부유액이 너무 진할 경우 고정액을 부유액이 약간 진해질 때까지 첨가한다.

 

슬라이드 만들기

 

1. Pasteur pipet을 이용하여 cold wet slide(~4℃)에 세포부유액을 2-3방울 정도 떨어뜨린다.

   (44%-49%정도의 습기가 유지되는 곳에서 작업을 한다.)

2. 만약 염색체가 잘 분산되지 않았으면 2-3방울 정도 다시 떨어뜨리고, 알코올버너를 이용하여 화염처리한다. FISH검사를 하고자 할 경우에는 화염처리하지 않는다.

3. 공기 중에서 마르도록 슬라이드를 평편한 곳에 둔다.

4. 20-24시간 동안 60-65℃의 건조기(drying oven)에 슬라이드를 넣어둔다. 시간이 없어 빨리 슬라이드를 사용해야 하는 경우에는 90℃에서 1시간 정도 두어도 된다. FISH를 하고자 할 경우에는 슬라이드를 건조기(dry oven)에 넣지 않도록 한다.

 

 

3. 말초혈액 도말(peripheral blood smear)

 

Standard protocol

 

1. 말초혈액을 slide glass 위에 20㎕ 정도를 떨어뜨린 후 도말한다.

2. 검체부위를 를 diamond pen으로 표시한다.

3. 검체부위에 신선한 고정액(3:1 of methanol and acetic acid)을 첨가한 후 실온에서 10분 동안 incubation한다. (저배율 편광현미경를 이용하여 RBC가 용해가 되었는지 확인한 후 만약 세포가 용해가 되지 않았다면 3번의 과정을 반복한다. )

4. 슬라이드를 바로 사용할 경우 2 X SSC에 37℃에서 30분간 방치한 후 FISH 순서를 진행한다.

5. 만약 슬라이드를 바로 사용하지 않을 경우에는 70%, 85% 그리고 !00% 에탄올에서 각각 2분간 방치한 후 냉동 보관한다.

6. 용해하기 어려운 세포를 위해서는 다음과 같은 protocol을 사용한다.

a. 혈액을 원심관에 넣은후 1000rpm에서 8분동안 원심분리 한다.

b. 완충층(buffy coat)을 조심스럽게 뽑아낸다.

c. 신선한 고정액(methanol : acetic acid=3:1) 8ml을 넣은 후 조심스럽게 vortex mix한다.

d. 실온에서 5분 동안 방치한다.  

e . 1000rpm에서 8분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거한다.

f. 신선한 고정액를 넣고 재 부유시킨 후 d, e의 과정을 반복한다.

g. 슬라이드 위에 떨어뜨리고, FISH를 위한 순서를 진행한다.  

 

   CHROMOSOME IN SITU HYBRIDIZATION SYSTEM

 

1) Pretreatment(전처치)

PH 7.0 조정된 2×SSC 용액 40ml를 copline jar에 넣고 슬라이드를 담구어 30분간 37°C에서 방치한다. Ethanol에 슬라이드를 넣어 dehydration한다.

70% ethaol(2분) → 80% ethanol (2분)  → 95% ethanol (2분) →  air dry.   실온에서 실시

 

2) Denaturation

  Denaturation sol : 실험할때마다 만들어서 사용

  (4ml 20×SSC + 8ml DW + 28ml formamide = 40ml)

  PH 7.0으로 맞춰진 denaturation sol 40ml를 copline jar에 넣고 슬라이드를 담구어 70°C Oven에 2분간 담군다.           

  Ethanol에 슬라이드를 넣어 탈수(dehydration)시킨다.

  70% ethanol (2분) → 80% ethanol → 95% ethanol (2분) → air dry  -20°C 냉동고에서 실시

 

3) Rapid hybridization

  슬라이드에 pap pen으로 원을 그린다.

  probe(α-satellite)를 10㎕를 apply한다.

  grass cover slip을 덮고 37°C humidified chamber에 넣고 30분간 incubation시킨다

  * unique sequence는 16시간 (overnight)

  (2) 3×SSC (PH 7.0) 에 넣고 5분간 72°C에서 세척한다.

  1×PBD에서 2분씩 3번 담군다.

  (1×PBD =   39ml: 10×PBD

               351ml: DW        total 390ml --->  4°C에서 1년 보관

 

4) Detection

  excessive PBD를 제거 조심스럽게 제거한다.

  60㎕(50㎕) Anti-digoxigenine을 떨어뜨린 후 plastic cover slip으로 덮고,  37°C humidified chamber에서 20분간 방치한다.

  1×PBD 에 2분씩 3번 세척한다.

 

5) Chromosome counter staining

  10㎕ PI/antifade를 떨어뜨리고 grass cover slip(oncor cat#: s1370-12)으로 덮어씌운다.

  암실에서 검경하면서 EY55 filter로 사진촬영한다. (100개 세포에서 signal number를 계수한다.)

  cf) PBD에 약 20초만 담그어도 sealant는 떨어진다.

      탈염색(destaining)을 위해서도 약 5분은 1×PBD에 담그어야 한다.

      PI 투여후 fluorescent single이 약하다.( Y 455가 가장 강함.)