Methotrexate-Synchronized Lymphocyte Culture Technique

 

 

 

림프구 배양 (Lymphocyte Culture)

 

1) RPMI1640 배지에 20% FBS, 2.0% pen-strep (5,000 units/mL penicillin & 5,000g/mL streptomycin), 2.0% L-glutamine(29.23 mg/mL)을 첨가하여 보충배지(supplemented media)을 만든다.

2) 두개의 배양용 플라스크(Falcon, #3013, 25 cm2 growth area)를 준비해서 다음 조작을 시행한다.

     (a) 배양용 플라스크 4개를 준배해서 보충배지 5ml씩을 첨가한다.

     (b) 27G 바늘로 heparin 한방울(1,000 units/ml) 씩을 첨가한다.

     (c) Eppendorf pipette를 사용하여 PHA 200 μl를 첨가한다.

     (d) 주사기에 채취된 혈액을 잘 섞은 후 주사침을 제거하고 배지에 혈액 5방울씩 첨가한다.

     (e) 플라스크의 마게를 완전히 막고 잘 섞는다.

     (g) CO2 배양기에서 37oC, 72시간 동안 똑바로 세운 상태로 배양한다.

3) 동기화(synchronization) 과정을 유도하기 위하여 amethopterin (Lederle Methotrexate sodium parenteral, 2.5 mg/ml)을 최종농도 10-7 M가 되도록 하는데, 5 ml 배지에 10-5 M MTX 용액을 50 μl 첨가하면 된다.

4) CO2 배양기에 넣고 17시간 동안 배양한다.

5) 16x125 mm round tube을 준비해서, 상기 두개 플라스크의 내용물을 한개 튜브에 합하고 200 G (1,100rpm)에서 8분 동안 원심분리한다.

6) 상층액을 제거하고 남은 상층액은 0.5 ml 이하가 되도록 한다.

7) 상온의 unsupplemented RPMI 1640 10 ml 첨가하고, 잘 섞어 세포를 재부유시킨다..

    *) 다른 종류의 배지 또는 멸균된 HBBS을 사용할 수도 있다.

8) 다시 200G (1,100rpm)에서 8분동안 원심분리한다.

9) 상기와 같은 방법으로 2회 더 세척한다.

10) 세척이 끝난 후 supplemened RPMI 1640 10 ml를 첨가하여 재부유한다.  세포부유액은 멸균 플라스크에 옮긴 후 CO2 배양기에서 넣는다.

   (a) supplemented RPMI 1640 media :10-5 M tymidine이 포함.

       10-3 M tymidine을 만든다. 먼저 10mg tymidine (M.W. 242.23)을 HBSS 40CC에 넣어 녹인 후, RPMI 1640 10ml에 10-3 M tymidine 100 μl을 첨가한다.

11) 37oC incubator 에서 5시간 5분, 5시간 15분 또는 5시간 30분 동안 세포를 release시킨다. 검체에 따라서 적절한 releasing time이 다르기 때문에 두가지 이상의 releasing time을 적용하는 것이 좋다.

12) Colcemid는 최종농도가 0.05 g/ml (배지 10 ml당 colcemid 10 g/ml solution을 50 g/ml (배지 10 ml당 colcemid 10 g/ml solution을 50 μ1) 되게 첨가하고 37o에서 10분 동안 방치한다. 이 때 colcemid time 및 농도을 정확히 지키는 것이 아주 중요하다. 또한 colcemid time은 releasing time에 포함된다.

 

 

수획단계 (Harvest)

  

1) Colcemid 처리후 8-9분 경에 플라스크의 내용물을 cornical centrifuge tube에 옮기고 colcemid time이 10분일 때 원심분리를 시작한다

2) 200G, 8분 동안 원심분리한다.

3) 상층액을 제거한다. (상층액을 0.5 ml 이상 남기지 말것).

4) 아래 세포층(cell pellet)을 수동으로 완전히 재부유시킨다.

5) 37oC의 신선한 0.075 M KCI 8 ml을 조심스럽게 첨가하면서 완전하게 섞어준다.

6) 37oC CO2 incubator나 수조에다 10분 동안 방치한다.

7) 200G, 5분 동안 원심분리 한다.

8) 세포층(cell pellet) 위쪽 상층액 0.1- 0.2 ml만 남겨두고 나머지 상층액은 모두 제거한다.

9) 세포 고정단계 : 세포층를 재부유시키고 pasteur pipette로 고정액을 한방울씩 첨가하면서(2 ml 까지) 계속 흔들어 준다. 고정액은 신선한 methanol: acetic acid 비율이 3:1인 용액이다.

10) 다시 고정액 4-5 ml을 더 첨가하고 섞는다.

11) Parafilm으로 시험관를 단단히 막아 20분간 실온방치한다.

12) 200G, 5분 동안 원심분리 한다. 고정액은 항상 신선한 것을 사용하여야 한다.

13) 최소한 6회 세척과정을 반복시행한다.

14) 가능하다면 세포수획 과정이 시행되는 당일 슬라이드 표본제작하는 것이 좋다.

15) 만일 냉장고에서 하루밤 동안 보관하였다면 표본제작 전에 시험관을 냉장고에서 꺼내어 상온이 되게 한 후에 고정액으로 2-3회 더 세척한다.

 

 

슬라이드 제작단계 (SLIDE PREPARATION)

   

1) 고정액으로 세포부유액을 적절한 농도로 희석한다.

2) 깨끗한 슬라이드(70% ethanol로 세척)를 30o 각도로 기울게 해서 바닥에 놓고 1 ml 떨어진 수직 위치에서 세포부유액을 2-3방울 떨어뜨린다.

3) Wet cold slide와 dry room temperature slide를 모두 검사한다. 그 이유는 pellet나 연중 시간에 따라 양호한 결과를 나타내는 방법이 다르기 때문이다.


  

 염색체검사용 배지 및 시약

 

배지 및 시약   

제조원

 Cat.N0.

 

RPMI medium 1640 

GIBCO  

430-1800 EB

 

Chang medium B (Basal medium)

GIBCO  

CB 10302

 

Chang medium C (Lyophilized supplement)  

GIBCO  

CC 10808

 

Hank's balanced salt solution 

IRVINE-SCIENTIFIC

450-1201

 

Dulbecco's phosphate buffer saline  ( D-PBS) 

 

450-1300

 

Phytohemagglutinin(PHA) M

 

 

 

Pokeweed mitogen(PWM)

 

 

 

Hepes  

SIGMA    

H-3375

 

Sodium bicarbonate(NaHCO3)  

SIGMA     

S- 8875

 

Heparin sodium salt 

GIBCO

820-5077MF

 

Fetal calf serum

GIBCO

220-6140

 

L-Glutamine (200mM)  

GIBCO

320-5039 AE

 

Penicillin-streptomycin

GIBCO

600-5145 AE

 

Colcemid solution

GIBCO

120-5211 AD

 

Collagenase(Lyophilized)   

GIBCO

840-7018 IH

 

0.05% Trypsin-EDTA(1;125)  

GIBCO

610-5300 AG

 

Potassium chloride

 SIGMA

P-4504

 

Methanol

( ACS grade)

 

 

Acetic acid

( ACS grade)

 

 

Giemsa

 BDH

35086

 

  0.5% Trypsin-EDTA

GIBCO

610-5400 AG

 

0.025 M potassium phosphate,   monobasic 

SIGMA

P-5379

 

Phorbol 12-myristate 13-acetate (12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate)

Sigma

 

 

P-8139  

 

 

 1mg  $25.9

 

 

 

 


 High-Resolution Banding Technique Using Ethidium Bromide

 

 

1. Materials, reagent & equipment

 

Materials
Peripheral blood

 

Reagent
RPMI 1640(Gibco BRL 11875-093, store 2 to 8℃)
Fital bovine serum(Gibco BRL 16000-044, activation후 사용, store -5 to -20℃)
Pen & streptomycin(Gibco BRL 15140-122, store -5 to 020℃)
Pokeweed mitogen(Gibco BRL 15360-019, 분말을 증류수에 녹여서 사용, store -5 to -20℃)
Heparin(2,000IU/ml, store 2 to 8℃)
Etidium bromide(Sigma chemical co E-8751, 증류수에 녹여서 사용, 10㎕/ml, store -5 to -20℃)
Newborn calf serum(Gibco BRL 26010-074, store -5 to -20℃)
Acetic acid(Junsei chemical co 31010-0350, 99.7%)
Methanol(Hayman limited 200-659-6, 99.85%)
Colcemid(Gibco BRL 15212-012, store 2 to 8℃)
Giemsa staining solution(BDH 350864X, store room temprature)
Gurr's buffer(Gibco BRL 10582-013, 정제를 증류수에 녹여서 사용, store 2 to 8℃)

 

Equipment
CO2 incubator, Centrifuge, Water bath, Refrigerator, Chemical balance, Slide warmer, Pipet, Pipet aid, Filter flask, Culture bottle, Beaker, Alcohol lamp, Micro pipet(1000㎕), Blue tip, Pasteur pipet, Bulb, Rack, Centrifuge tube, Slide glass, Coplin jar, △ Flask, spoon, vaccum tube, syringe(1ml).

 

2. Procedure

 

Culture
1) Composition of Culture Medium(1 sample base)
    RPMI 1640 : 9ml(90%), Pen. & Streptomycin : 0.1ml(1%), Pokeweed : 0.1ml(1%),
    Heparin : 0.1ml(1%), FBS : 1ml(10%)
2) Blood collection with heparinized vaccum tube
3) Making medium
    Mix media and & supplements -----> filteration(0.2μm) -----> seperate about 10ml in culture bottle -----> pre-warming at 37.0℃, 5% CO2 incubator ( 2hrs )
3) Add blood
    0.5ml whole blood in each culture bottle
4) Culture at 37℃, 5% CO2 for 72 hours

 

Harvest
1) Add 0.1ml EtBr(10㎍/㎖) in each culture bottle and reincubation for 2.5 hour.
2) Colcemid injection (10㎍/㎖, 0.02㎖)
3) Reincubation for 30min.
4) Transfer culture concents to centrifuge tube
5) Centrifuge at 1000rpm for 10min
6) Discard supernatant by pasteur pippet
7) Hypotonic treatment(5ml) for 20min. at 37℃ water bath (dropwise)
    Hypotonic solution: NCS 1 & D.W. 3
8) Centrifugation at 1000rpm for 10min.
9) Discard supernatant by pasteur pippet
10) Fixation(1:3 acetic acid & methanol) with dropwise and final volume was 5ml
11) Store at refrigerator for overnight
12) Centrifugation
13) Fixation(5ml)
14) Centrifugation
15) Fixation
16) Centrifugation
17) Fixation
18) Centrifugation
19) Add 20 drops of fixative solution in each sample
20) Preparation of 5 slides in each sample( 4-5 drops in each slide)
21) Dry at warmer plate for 30min.
22) Stain with 4%Giemsa stain for 5min