Proteomics

 

 

주어진 환경에서 유전체(genome)에 의하여 발현되는 단백질들을 단백체(proteome)라 하며, 이를 연구하는 학문을 단백체학(proteomics)이라고 한다. 어원은 "the set of PROTEins coded by a GenOME"에서 비롯되었다. 최근, Proteomics가 대두된 이유는  첫째, mRNA의 발현으로 단백질의 발현을 예측할 수 없으며, 둘째, 단백질이 변형(methylation, phosphorylation 등등)된 것을 gene sequence에서는 알 수 없으므로 proteome을 연구하게 된 것이다.

일반적으로 genome에 의해 mRNA로 전사가 되면 그 전사가 된 것을 리보솜안에서 단백질로 번역해 낸다. 하지만 genome의 정보는 전사 과정에서 intron이라고 하는 비정보 영역과 exon이라고 하는 정보 영역을 선택적으로 취하게 되고 이것을 다시 번역과정에서 변형시켜서 최종적인 단백질로 되는 것이다. 따라서 우리가 정확한 유전자의 배열을 안다고 해도 실재 세포내에서 기능을 담당하는 단백질과는 차이가 난다는 것이다. 이러한 맹점이 genome project 연구에서 proteomics 연구로 진행된 배경이 될 수 있다.

   이들 Proteome 분석은 다음과 같은 특성을 가지고 있다.
1) 정제 과정 없이 조직, 개체등 시료에 존재하는 모든 단백질을 펼쳐 분석할 수 있다.
2) 유전자의 발현 정도를 한 눈에 알 수 있다.
3) 유전자에 의한 현상과 유전자 외적요인(multigenic/epigenic)에 의한 현상을 쉽게 추적할 수 있다.
4) 정상조직과 질병 조직, 그리고 좋은 품종과 나쁜 품종간의 단백질 발현 차이를 알 수 있다.

그 예로 APAF의 Chiron Project를 들어보면, 동일한 암 환자의 경우에도 전이가 빨리 진행된 경우의 환자와 전이가 안된 환자의 세포주에서 얻은 chiron으로 219개의 protein spot을 분석하였다. 그 결과 205개의 spot은 이미 알려진 단백질 이었고, 14개의 새로운 protein spot을 찾아냈다. 이들 두 시료의 차이점은 125개의 다른 protein spot을 찾아 냈으며, 이들은 대부분이 phosphorylation 및 glycosylation 등의 post-translational modification에 의한 것으로 밝혀졌다. 그리고, 서로 다르게 발현된 25개의 단백질을 알아냈고, metastasis와 관련된 2개의 단백질, cancer관련된 18개의 단백질등을 알아낼 수 있었다. 또한 이들 새로운 단백질중 4개는 heat shock protein을 포함한 phosphoprotein임을 알아냈다. 이와 같이 proteome을 연구의 활용 분야는 크게 진단과 치료제 개발 그리고 동식물의 품종 개량 등이다.

 

     

    표 1. Genome과 Proteome의 비교

    Genome

    Proteome

    유전정보 (DNA)의 총체

    단백질의 총체

    개체마다 유일함

    한 개체에도 수없이 많음

    생명체 설계도의 해독

    기능단위의 총체적 해독

    연구와 산업의 기본 Data

    산업에 직결된 Data

    미국이 독점

    호주, 스위스, 덴마크등이 선도


 

Proteome Analysis의 전반적인 Work Flow는
1) Sample preparation
2) 2-D Electrophoresis
3) Staining
4) Image Acquisition
5) Image Analysis
6) Protein Excision
7) Protein Identification으로 각 단계별 자세한 설명은 다음과 같다.

 

 

1. Sample preparation

 

Ready Prep Sequential Extraction kit: Sample Preparation시 가장 중요한 점은   ① 얼마나 잘 녹는가? ② 적은 양의 단백질로 2-D spot을 잘 볼 수 있는가이다

 

 

 

 

2. 2-D Electrophoresis

 

  • 1-D : PROTEAN IEF Cell ( 7 cm & 17 cm), ReadyStrip IPG strips
  • 2-D :
        PROTEAN II xi Cell, Multi-cell + IPG conversion kit
        ( = PROTEAN II XL wide format cell, PROTEAN II XL multi-cell)
        Mini PROTEAN 3 Electrophoresis system
        Reagents : PROTEAN II Ready Gel Precast gels for 2-D, Ready gels,
        Polyacrylamide Gel Electrophoresis reagents

    1) ReadyStrip IPG stripsB
      - semi-dry상태(4% gel)로 반드시 hydration step을 거쳐야 한다.
      - Hydration 방법 : Passive, Active
      - Hydration시 필요한 buffer의 양 : 300 ul

 

특 징

장 점

1. 종류 : pH 3-10, pH 4-7
             pH 3-6, pH 5-8, pH 7-10

좁은 범위의 pH gradient strip이 있어 복잡한 시료들 분리가 가능함.

2. 길이 : 7cm, 17 cm

2-D를 위해 strip을 자를 필요가 없다.

3. IPG gel의 길이 오차 : ±2 mm

Electrode사이에 일정한 gel alignment 가능하므로protein spot의 pattern이 일정, 즉 pI 의 shift가 없다.

4. strip의 anode 끝에 "+" 표시

동시에 여러 개를 run하더라도 혼동이 없다.

     

    IPGphor, 18 cm

    IPGphor, 7 cm

    Bio-Rad, 17 cm

    Bio-Rad, 7 cm

    Electrode
    distance

    170 mm

    60 mm

    162 mm

    64.5 mm

    Electrode
    distance

    170 mm

    60 mm

    162 mm

    64.5 mm

    Gel length

    182 ± 5 mm

    70 ± 54mm

    168 ± 2 mm

    72.5 ± 2 mm

    Total Strip
    length

    198 mm

    78 mm

    174 mm

    79 mm

 

    2) PROTEAN IEF Cell



    - Tray가 플라스틱으로 되어 있으며, 이는 hydrophobic하여 channel 사이의 cross contamination이 없다.
    - Tray 종류 : rehydration/equilibration trays(passive rehydration, equilibration), Focusing trays(active rehydration,                    focusing)
    - Sample run시 mineral oil을 덮어주어 buffer의 증발을 막아 준다.
    - Program을 프린트 하려면, VersaFluor fluorometer에 사용하는 thermal printer를 RS-232 port를 이용하여 연결한다.
    - Sample 용량 : 7 - 30 ul
    - Sample loading은 passive rehydration인 경우 rehydration후에, 그리고 active rehydration인 경우 rehydration시    실행한다.
    - Programming Parameter : Rehydration time, focusing time, platform temperature, current limit per strip, voltage, voltage                                         ramping type for each step
    - Voltage ramping profile : rapid, linear, slow
    - 10개의 program 저장가능, program마다 9 step까지 가능
    - Current : 0 - 3 mA
    - Power : 3 Watts
    - Components : Basic unit, focusing trays with lid (7, 17 cm), rehydration/equilibration trays with lid, forceps (2),                         electrode wicks(1pk), mineral oil, cleaning brush

 

    특 징

    장 점

    1. 12개의 strip을 동시에 run
      (mini인 경우 24개까지 가능)

    동시에 많은 시료를 running할 수 있다.(IPGphor인 경우 gel strip의 size에 관계없이 1 tray에 1strip으로 12개 까지 가능)

    2. 최대 10,000 volt

    Large strip 사용 시 conductivity가 낮은 시료를 빠른 시간 내에 running 가능.(IPGphor : 8,000 volt)

    3. Peltier Cooling, 10 - 25℃ 온도조절

    일정한 온도를 유지할 수 있어 재현성 있는 결과를 보여준다.(IPGphor : 18 - 25℃)

    4. 3개의 semi-programmed method가 저장

    실험 조건을 잡는데 용이 하며, 초보자도 쉽게 사용할 수 있다.(IPGphor : no)

    5. LCD에 4 lines, 22자까지 표시

    (IPGphor : 2 lines, 16 자)(IPGphor : no)

    6. Compact, Single box

    공간을 적게 차지
    (IPGphor에 비해 약 30% 적게 차지)

 

    3) PROTEAN II Precast gels
    - Size : 20 x 20 cm
    - Gel % : 12%, 10-20%, 8-16%
    - Thickness : 1.0 mm
    - 2-D Prep Comb (single well)
    - Shelf life : 2 - 3 months

 

 

3.Staining

 

1) In Gel Detection :
 - Silver Staining : 0.5 -1.2 ng(detection limit)
: Silver Stain(mass spec.에 사용 불 가), Silver Stain Plus Kit
 - Bio-Safe commassie stain: 8-26 ng,
 - SYPRO Orange Stain : 2 - 10 ng
2) In Blot Detection
 - Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell, Sequi-Blot PVDF membrane

 

 

4. Image Acquisition

 

- GS-710 Calibrated Imaging Densitometer,
- Fluor-S MAX MultiImage System,
- Molecular Imager FX

 

 

5. Image Analysis

 

- PDQuest 2-D Software,
- Melanie II 2-D software

 

 

Protein Excision

 

: PROTEAN 2-D Spot Cutter 2-D spot cutter

1) 특징:
  - 정확한 spot selection
  - 정밀한 spot cutting
  - 자동화된 excision
  - 한꺼번에 많은 spot을 cutting : 20분 안에 96개의 spot을 cutting.
  - 한 spot에서 10번까지 cutting하여 한 well에 모을 수 있다. (batch method)
  - High pixel resolution : 1,280 x 960 pixels (0.01 mm까지 정확하게 이동)
  - Cutting Area : 11.8 x 8.8 cm (mini gel, large gel 모두 가능)
  - Gel Frame이 있어 spot cutting시 gel이 마르는 것을 방지.

2) Software : SpotOn S/W
  - Point, Click, Cut
  - High resolution zoom으로 인한 정확한 spot selection
  - Spot number 자동으로 지정
  - 각 Spot의 위치가 자동으로 기록
  - Text file로 저장하여 spreadsheets혹은 database로 볼 수 있다.
  - Post-cut image file을 이용해 결과에 대한 graphics로 사용할 수 있다.

 

 

 


 

[신경] 프로티오믹스를 이용한 알츠하이머병 진단법 개발동향

Oxford GlycoSciences사는 NIH, FDA의 공동 후원으로 진행된 컨퍼런스에서 단백질의 기능, 확인 및 동정에 관한 최근 연구법과 과학적 접근법을 소개하면서 이를 이용한 알츠하이머병 진단을 위한 바이오 표지자 개발 동향을 발표했다.

OGS사의 주제발표자인 파렉 박사는 병리 조직이나 세포에 의해 분비되는 단백질의 검출, 진단 및 병의 평가에 관해 발표하면서 단백질 표지자 발견을 위한 각종 제한들이 프로티오믹스 기술발전에 따라 극복되고 있다고 소개했다. 현재 OGS사와 화이저사는 공동으로 알츠하이머병 진단과 진행과정을 확인하기 위한 새로운 임상 표지자 발견을 위한 프로티오믹스 (Proteomics) 공동연구를 진행하고 있다. 또, 이날 발표자로 나온 NIH의 하롤드 바머스 박사와 FDA의 제인 헨니박사는 OGS사의 PharmacoProteomics (TM) 프로그램은 알츠하이머병 진행 확인을 위한 단백질 표지자의 발견 및 확인에 응용할 수 있을 것으로 평가했다. OGS사는 프로티오믹스를 이용하여 류마티스 관절염, 유방암 및 간암 등 각종 질병에 특이적인 단백질의 발견, 확인, 동정법 등에 대한 특허를 최다 보유하고 있다.

프로티오믹스는 게놈에 의해 코딩된 각종 단백질의 대용량 분리, 확인 및 동정하는 기술로 표준 샘플 조직에서 분리 동정된 단백질과 비교를 통해 질병을 진단하거나 단백질 치료제 등을 개발하는 신기술로 포스트 게놈 후의 가장 유망한 분야로 손꼽히고 있다.

(참고: Oxford GlycoSciences plc, Web: http://www.ogs.com/)  1999 . 4. 20

 

 

 


유전체 다음 단계는 단백질 정체 규명

 

프로테오믹스 (단백질 유전체학, Proteomics)

인간 지놈(유전자)의 완전 해독에 이어 앞으론 단백질 연구가 본격화할 전망이다. 인간지놈 지도 완성결과 유전자가 당초 예상보다 훨씬 적은 3만여개에 불과하고, 하나의 유전자가 한개의 단백질을 생성하고 이것이 한 질병과 연결될 것이라는 전제가 무너지면서 단백질의 정체를 밝히는 작업이 차세대 연구과제로 떠오르고 있는 것이다.

영국의 파이낸셜타임스는 최근 "인간지놈 연구를 주도했던 미 생명공학회사인 셀레라지노믹스와 하버드대. 미시간대. 도쿄대. 런던 임페리얼대, 그리고 스위스의 유명 제약회사 로슈 등이 최근 단백질 연구를 위한 컨소시엄인
'HUPO' 를 만들기로 합의했다" 고 보도했다. 오는 4월 공식 출범할 이 컨소시엄의 목표는 단백질의 정체를 밝히는 일이다. 그래야만 궁극적인 목적인 불치병 해소가 가능해지기 때문이다.

지난주 발표된 인간지놈지도는
한개의 유전자가 많게는 수백가지의 단백질을 만든다는 새로운 사실을 일깨워줬다. 따라서 중요한 것은 유전자 자체가 아니라 각각의 유전자가 복잡한 상호작용을 거쳐 만들어내는 단백질 조합이라는 게 과학자들의 일치된 견해다. 전문가들은 단백질연구 프로젝트에는 수십억달러와 오랜 시간이 소요될 것으로 전망하고 있다. 데이터의 양도 유전자 프로젝트보다 약 1천배나 많고, 연구과정도 훨씬 더 어려울 것으로 보고 있다. 이런 가운데서도 하버드대 프로테오믹스(단백질 유전체학) 연구소는 이미 어느 정도 연구성과를 보고 있는 것으로 전해졌다. DNA 실험을 통해 새로운 단백질을 많이 찾아내 현재 그 수가 3만개에 이른다는 것이다.                                   [중앙일보 2001년2월 20일]

 

 [2001년 4월24일 수정]