미생물검사의 분자유전학

 

     

Chlamydia trachomatis

임상적 의의

C. trachomatis는 STD(sexually transmitted disease)를 일으키는 가장 흔한 원인균으로 성인에서 요도염을 비롯한 비뇨생식기계 감염을 일으키고, 감염된 산모를 통해 신생아에게 감염될 경우 결막염과 폐염을 일으킨다. C. trachomatis는 일반 검사실에서 배양이 쉽지 않아 주로 면역학적 방법으로 항원이나 항체를 검출하는 방법을 진단에 이용하여 왔다. C. trachomatis PCR검사는 면역학적 검사보다 높은 민감도나 양성예측도를 보여 질환의 진단에 유용한 검사로 여겨지고 있다.

검사방법

본 검사는 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 C. trachomatis의 cryptic plasmid 유전자 분획을 증폭함으로써 검체내에 있는 C. trachomatis를 검출하는 방법이다. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 target DNA가 단일가닥으로 변성되고(denaturation), primer가 template DNA의 상보적인 염기서열에 결합한 후(anealing) Taq polymerase가 결합된 primer를 시점으로 template에 해당하는 핵산을 합성(extension)하는 과정이 한 주기가 되어 반복하여 진행하는데 각 주기가 끝날 때마다 PCR 산물이 두배로 증폭하게되고 이론적으로 n번의 주기가 반복되면 2n배로 증폭되어 30주기를 시행하면 십억배의 증폭산물이 생성되게 되다. 그러나, 반응에 관여하는 여러 가지 영향으로 인해 실제로는 대개 28∼35 주기 후에 106∼106배 정도의 증폭산물이 생성된다. 따라서 PCR은 검체내에 포함되어 있는 소량의 DNA도 증폭을 통해 검출해 낼 수 있다는 것이 장점이다.   

시약

PCR에 이용되는 시약은 template DNA, primer, dNTP, Taq polymerase, 10X PCR buffer, H2O 등이다. Template DNA는 증폭하고자 하는 염기서열로 검체에서 추출한 DNA를 사용한다. Primer는 증폭하고자 하는 유전자 구간의 양쪽 끝에 상보적인 염기서열로 된 1쌍의 oligonucleotide로 이 primer를 시점으로 증폭이 일어나게 된다. dNTP는 유전자 증폭에 필요한 염기 재료이고 Taq polymerase는 DNA를 증폭시키는 특수한 효소이며 10X PCR Buffer는 이 효소가 작용하는데 있어 이온 등 적합한 반응조건을 만들게 된다.  

장비

Thermal cycler는 PCR을 시행하는 기본 장비로 유전자를 증폭시키는데 필요한 온도 변화 과정을 프로그램에 따라 자동적으로 시행하게 된다. GeneAmp PCR System 2700 (Perkin Elmer)과 Touchgene Gradient(Techne) 두 대의 장비가 사용된다.

    GeneAmp PCR System 2700 (Perkin Elmer) :  Peltier 방식의 heating/cooling unit를 도입하였으며 100여개의 프로그램을 저장할 수 있으며 96-well sample block이 장착되어 있다.  

    Touchgene Gradient (Techne) :  Peltier 방식의 heating/cooling unit를 도입하였다. 동시에 각 well 간에 온도 편차를 줄 수 있어 gradient PCR이 가능하다. sample block은 쉽게 교환이 가능하여 96-well sample block과 in situ PCR용 block을 교대로 사용할 수 있다.   

 

Neisseria gonorrhoeae

임상적 의의

N. gonorrhoeae는 임균성요도염과 같은 비뇨생식기계 감염을 일으키며 주로 성적접촉을 통해 전파된다. 신생아에서 결막염을 일으키기도 한다. N. gonorrhoeae를 검출하는 방법으로는 배양검사가 "gold standard"로 되어 있는데 배양검사의 민감도는 80∼95% 정도이며 N. gonorrhoeae는 운송, 보관 과정 중에 쉽게 사멸할 수 있어 검체를 즉시 배양하지 않을 경우 양성율이 감소하게 된다. N. gonorrhoeae PCR 검사는 민감도나 특이도가 남자의 경우 90∼99%, 여자의 경우 78∼98% 정도로 상당히 우수한 결과를 보이며, 검체 운송이나 수송 과정에 크게 영향을 받지않는 장점도 있다.

검사 방법

본 검사는 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 N. gonorrhoeae의 cppB 유전자 분획을 증폭함으로써 검체내에 있는 N. gonorrhoeae를 검출하는 방법이다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 target DNA가 단일가닥으로 변성되고, primer가 template DNA의 상보적인 염기서열에 결합한 후(anealing) Taq polymerase가 결합된 primer를 시점으로 template에 해당하는 핵산을 합성(extension)하는 과정이 한 주기가 되어 반복하여 진행하는데 각 주기가 끝날 때마다 PCR 산물이 두배로 증폭하게되고 이론적으로 n번의 주기가 반복되면 2n배로 증폭되어 30주기를 시행하면 십억배의 증폭산물이 생성되게 되다. 그러나, 반응에 관여하는 여러 가지 영향으로 인해 실제로는 대개 28∼35 주기 후에 106∼106배 정도의 증폭산물이 생성된다. 따라서 PCR은 검체내에 포함되어 있는 소량의 DNA도 증폭을 통해 검출해 낼 수 있다는 것이 장점이다.   

시약

PCR에 이용되는 시약은 template DNA, primer, dNTP, Taq polymerase, 10X PCR buffer, H2O 등이다. Template DNA는 증폭하고자 하는 염기서열로 검체에서 추출한 DNA를 사용한다. Primer는 증폭하고자 하는 유전자 구간의 양쪽 끝에 상보적인 염기서열로 된 1쌍의 oligonucleotide로 이 primer를 시점으로 증폭이 일어나게 된다. dNTP는 유전자 증폭에 필요한 염기 재료이고 Taq polymerase는 DNA를 증폭시키는 특수한 효소이며 10X PCR Buffer는 이 효소가 작용하는 데 있어 이온 등 적합한 반응조건을 만들게 된다.  

장비 : Thermal cycler

 

Ureaplasma urealyticum

임상적 의의

U. urealyticum은 nonchlamydial, nongonococcal urethritis의 중요 원인균이다. 여성에서  감염될 겨우 infertility의 원인이 될 수 있으며 산모가 감염되어 있을 경우 저체중아를 출생하거나 폐염, 뇌수막염, 패혈증을 일으키기도 한다. U. urealyticum은 일반 검사실에서 배양이 쉽지 않아 원인균 검출이 어려운데 PCR검사를 시행할 경우 빠른 시간에 높은 민감도로 진단이 가능하다.

검사방법

본 검사는 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 U. urealyticum의 urease 유전자 분획을 증폭함으로써 검체내에 있는 U. urealyticum을 검출하는 방법이다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 target DNA가 단일가닥으로 변성되고(denaturation), primer가 template DNA의 상보적인 염기서열에 결합한 후(anealing) Taq polymerase가 결합된 primer를 시점으로 template에 해당하는 핵산을 합성(extension)하는 과정이 한 주기가 되어 반복하여 진행하는데 각 주기가 끝날 때마다 PCR 산물이 두배로 증폭하게되고 이론적으로 n번의 주기가 반복되면 2n배로 증폭되어 30주기를 시행하면 십억배의 증폭산물이 생성되게 되다. 그러나, 반응에 관여하는 여러 가지 영향으로 인해 실제로는 대개 28∼35 주기 후에 106∼106배 정도의 증폭산물이 생성된다. 따라서 PCR은 검체내에 포함되어 있는 소량의 DNA도 증폭을 통해 검출해 낼 수 있다는 것이 장점이다.   

시약

PCR에 이용되는 시약은 template DNA, primer, dNTP, Taq polymerase, 10X PCR buffer, H2O 등이다. Template DNA는 증폭하고자 하는 염기서열로 검체에서 추출한 DNA를 사용한다. Primer는 증폭하고자 하는 유전자 구간의 양쪽 끝에 상보적인 염기서열로 된 1쌍의 oligonucleotide로 이 primer를 시점으로 증폭이 일어나게 된다. dNTP는 유전자 증폭에 필요한 염기 재료이고 Taq polymerase는 DNA를 증폭시키는 특수한 효소이며 10X PCR Buffer는 이 효소가 작용하는 데 있어 이온 등 적합한 반응조건을 만들게 된다.  

장비 : Thermal cycler